梁曉東，駱強(qiáng)翔，張偉明，莫淦文，郭江華，廖勇彬

(江門市中心醫(yī)院a.生殖醫(yī)學(xué)診療中心；b.病案科，廣東江門 529000)

輔助生殖實(shí)驗(yàn)室在胚胎培養(yǎng)時(shí)需要各種不同種類的培養(yǎng)液，這些培養(yǎng)液的質(zhì)量好壞直接影響到輔助生殖技術(shù)的成功率。其中所使用的精子培養(yǎng)液，是在精子優(yōu)化分離后添加的精子懸浮液，由于它能影響受精結(jié)局，有必要通過性能評(píng)估實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室試劑的質(zhì)量控制。目前評(píng)估的方法主要是精子存活試驗(yàn)，這個(gè)試驗(yàn)是通過觀察精子在不同時(shí)間點(diǎn)精子的活力來分析精子培養(yǎng)液質(zhì)量的方法。然而，精子活動(dòng)能力只是評(píng)價(jià)的一個(gè)方面，更重要的是受精過程中培養(yǎng)液是否能使精子獲能或頂體反應(yīng)等環(huán)節(jié)得到最大的發(fā)揮。能否通過檢測(cè)獲能環(huán)節(jié)相關(guān)的標(biāo)記物的改變來反映培養(yǎng)液質(zhì)量呢？現(xiàn)已知道，精子獲能伴有膜膽固醇外流的現(xiàn)象，最終使脂筏結(jié)構(gòu)重新分布[1-2]，從而使脂筏結(jié)構(gòu)內(nèi)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的位置改變。GM1是分布于細(xì)胞膜上的一種富含唾液酸的鞘糖脂，是構(gòu)成脂筏結(jié)構(gòu)的重要成分，可通過分析GM1的位置改變反映精子獲能相關(guān)膜脂筏結(jié)構(gòu)的改變[3]。由于GM1能與霍亂毒素B亞基(CTB)發(fā)生迅速結(jié)合，只要把熒光素標(biāo)記在霍亂毒素B亞基上，就可以對(duì)精子膜上的GM1進(jìn)行定位染色檢測(cè)[4-5]。本研究將嘗試用CTB對(duì)精子膜進(jìn)行染色，并且從不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同培養(yǎng)基精子的染色結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，探討提供精子功能環(huán)境所適合的精子培養(yǎng)液。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 男性精液樣本來自于本中心日常做精液檢查的患者。簡(jiǎn)單了解男方職業(yè)和不良生活史等信息后，選取非高溫環(huán)境工作、沒有不良生活史患者留取的精液標(biāo)本。只有完全液化的且高于WHO第五版精液檢查的正常參考值的精液標(biāo)本才納入本研究中。所有患者均知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：密度梯度離心液選用CooperSurgical公司的PureCeptionTM(40/80)(REF ART-2040，ART-2080)，Vitrolife IVF plus培養(yǎng)液購自Vitrolife公司，Quinn’s HTF精子培養(yǎng)液(REF ART-1020)購自CooperSurgical公司，精子標(biāo)記染色液采用Thermofisher公司的CTB-AlexaFluor 488連接物(REF C22841)，固定液多聚甲醛來自于北京索萊寶生物有限公司。

1.2.2 儀器：計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(西班牙Microptic公司)和Nikon 80i熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 方法

1.3.1 精液采集：精液標(biāo)本留取當(dāng)天要求禁欲3～5天，采用手淫法取精且收集到無毒的容器內(nèi)。

1.3.2 精液分析：精液標(biāo)本待其完全液化后按照WHO第五版精液檢查的操作規(guī)程測(cè)量精液量、精子濃度、精子活力及形態(tài)。

1.3.3 精液處理：采用不連續(xù)的密度梯度離心法分離精子，精子洗滌后分別用Quinn’s HTF培養(yǎng)液和Vitrolife IVF plus培養(yǎng)液重懸。然后再次分析處理后的精子濃度與活力。把精子濃度調(diào)整成(5～10)×106/ml后分別把兩種培養(yǎng)液中精子懸液分裝成5份，置于37℃，5%(v/v)CO2培養(yǎng)箱中獲能培養(yǎng)。于0，4，6，8和10 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別把精子懸液取出，進(jìn)行GM1的定位染色。

1.3.4 精子膜GM1的定位染色：參照MOODY等[6]的方法?；静襟E為：先把精子懸液離心去上清，用2 g/dl多聚甲醛于37℃固定15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次后，再次調(diào)整精子濃度為20×106/ml左右，然后加入等體積的50×10-6g/ml的CTB-Alexa Fluor 488連接物染色15 min。染色結(jié)束以后再次使用PBS洗滌三次，重懸精子沉淀物并涂片。使用熒光顯微鏡在激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長520 nm濾光片下觀察分析染色結(jié)果，再按照MOODY等[6]的方法對(duì)至少200條精子進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，計(jì)算頂體區(qū)有熒光的精子百分率(AA%)。

2結(jié)果

2.1 精液樣本的總體情況分析 符合條件的精液樣本共有48份，其中：精液量為3.7±1.6 ml，精子濃度為(58.75±7.88)×106/ml，精子活動(dòng)率(前向運(yùn)動(dòng)加非前向運(yùn)動(dòng)百分率)為(51.55±15.62)%，精子形態(tài)正常率為(6.04±2.31)%。

2.2 精子膜GM1的定位染色 染色結(jié)果見圖1。其中頂體前區(qū)(AA)發(fā)出綠色熒光信號(hào)的是已獲能的精子(圖1黑色箭頭)，而精子頭部沒有熒光信號(hào)的是非獲能精子(圖1白色箭頭)，與MOODY等[6]的研究結(jié)果一致。

(40×，激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長520 nm)

2.3 兩種培養(yǎng)液之間GM1染色結(jié)果的分析比較 各時(shí)間點(diǎn)精子的活動(dòng)率和AA%見表1和圖2。從圖2可以看出，AA%隨著時(shí)間延長而升高，表明獲能精子隨著時(shí)間的延長而增加，而兩種培養(yǎng)液曲線基本接近。把測(cè)量時(shí)間作為重復(fù)因子，培養(yǎng)液分組作為主體，使用混合效應(yīng)模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)液之間的AA%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.096，P=0.923)。

表1 兩種培養(yǎng)液在不同時(shí)間點(diǎn)的精子活動(dòng)率與AA%結(jié)果比較

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)兩種培養(yǎng)液的AA%

3討論隨著宮腔內(nèi)人工授精技術(shù)和常規(guī)體外受精技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)于技術(shù)中所使用培養(yǎng)液的質(zhì)量越來越重視。培養(yǎng)液的好壞直接關(guān)系著妊娠結(jié)局和實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制結(jié)果。在這些輔助生殖技術(shù)中，精液處理過程是其中重要的一環(huán)，當(dāng)中所用的精子培養(yǎng)液可以提供精子超激活運(yùn)動(dòng)中的能量需要，因此目前對(duì)于精液培養(yǎng)液在維持精子活動(dòng)方面的評(píng)判，主要通過在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)分析精子活力或者精子運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)來進(jìn)行[7]。而在另一方面，這些培養(yǎng)液還具有在體外條件下使精子發(fā)生獲能的功能，以進(jìn)一步為精卵的結(jié)合提供環(huán)境[8]。故此研究者更關(guān)心的可能是精子受精能力的獲得及精子功能的發(fā)揮等對(duì)精卵融合的直接影響因素。GM1在精子獲能時(shí)重新定位的現(xiàn)象，為我們提供了一種研究工具用于評(píng)估精液培養(yǎng)液在發(fā)揮精子受精功能方面的作用。先前已經(jīng)有學(xué)者報(bào)道使用這一工具對(duì)比了幾種商品化的精子培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)各種培養(yǎng)液在促進(jìn)精子功能方面的不同[9]。由于我中心生殖實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用Vitrolife IVF plus培養(yǎng)液和Quinn’s HTF培養(yǎng)液作為精子維持液，故此研究中使用了這兩種培養(yǎng)液來比較，結(jié)果說明兩種培養(yǎng)液均能提供發(fā)揮受精功能的環(huán)境，但這一結(jié)論仍需要生殖實(shí)驗(yàn)室的各種胚胎培養(yǎng)數(shù)據(jù)的支持和結(jié)合實(shí)際受精情況綜合分析[10]。

本研究在對(duì)比兩種培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)過程中采用了CTB結(jié)合染色法，主要基于GM1能與CTB能發(fā)生迅速結(jié)合的原理，但這種方法的關(guān)鍵是如何確定精子GM1在獲能條件和非獲能條件下的分布定位。MOODY等[6]選取了凝集素受體作為參照，對(duì)每一條精子使用CTB與花生凝集素(PNA)對(duì)精子進(jìn)行雙染色，證實(shí)獲能精子的GM1分布于頂體區(qū)。在本研究中，GM1在獲能條件下的定位染色結(jié)果與MOODY等[6]基本一致。另外，人類精子膜有著很高的膽固醇/磷脂的比例，故人類精子中需要較長的時(shí)間才可以獲能。這個(gè)時(shí)間跟使用的誘導(dǎo)物也有關(guān)系，實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)液中的誘導(dǎo)物來源于清蛋白[11-12]，而添加清蛋白的培養(yǎng)液中至少要6 h才開始觀察到獲能現(xiàn)象的出現(xiàn)[13]。在本研究中，從4 h開始觀察不同時(shí)間點(diǎn)的頂體區(qū)有熒光信號(hào)的精子百分率(AA%)，發(fā)現(xiàn)AA%隨時(shí)間延長而增加，表明獲能精子的數(shù)量逐漸增加。

一項(xiàng)有效的功能檢測(cè)技術(shù)應(yīng)當(dāng)與臨床診斷相關(guān)性好，能指導(dǎo)輔助生殖技術(shù)的使用策略，而且方法簡(jiǎn)單可行。對(duì)于不孕不育原因和輔助生殖技術(shù)結(jié)局的分析，傳統(tǒng)的精液參數(shù)如精子濃度、形態(tài)等顯然已經(jīng)不能滿足臨床的需要，亟待開發(fā)新的精子功能分析項(xiàng)目，如精子DNA碎片檢測(cè)等對(duì)精子發(fā)生、受精等過程出現(xiàn)的異常尋找男性不育的病因和指導(dǎo)輔助生殖技術(shù)的選擇策略[14]。而精子受精功能分析憑借其能在體外模擬精卵結(jié)合環(huán)境的優(yōu)勢(shì)被日益重視，在眾多評(píng)估手段中使用CTB檢測(cè)精子GM1定位的方法是一項(xiàng)獨(dú)立于傳統(tǒng)精液參數(shù)又能用來分析男性不育的病因的技術(shù)[15]。過去人們基于獲能現(xiàn)象及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)，逐漸發(fā)展出以蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的方法來檢測(cè)精子獲能。這種方法要做免疫印跡，耗時(shí)較長，而使用CTB的熒光素結(jié)合物來檢測(cè)獲能的方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，花費(fèi)少[16]，這些優(yōu)點(diǎn)有望成為一項(xiàng)易于推廣的精子功能分析的檢測(cè)技術(shù)。

綜上所述，本研究建立了使用CTB檢測(cè)精子GM1定位的方法并以其對(duì)比分析了兩種不同培養(yǎng)液中精子獲能情況，為進(jìn)一步研究培養(yǎng)液對(duì)臨床結(jié)局的影響及該方法的臨床價(jià)值打下了基礎(chǔ)。