孟虹英

（天康生物股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000）

1 材料與方法

1.1 實驗器材

使用37℃恒溫生化培養(yǎng)箱、若干個單道、12 道移液器、若干個96 孔 U型反應(yīng)板、量筒100 ml 、iMark- 酶標(biāo)儀。

1.2 血清樣品

隨機(jī)采集血液樣品48分，但前提是樣品必須經(jīng)過豬口蹄疫 O型滅活疫苗二次免疫后約 40 d 的 95 ～ 120 日齡育肥，將血清進(jìn)行分離之后，放置于 4℃冰箱保存待測。

1.3 檢測方法

1.3.1 口蹄疫抗體 O 型競爭 ELISA

嚴(yán)格按照試劑盒說明書開展操作，對于兩孔的平均 OD 值后乘以 0.6進(jìn)行計算，所得的結(jié)果就是臨界值，主要是用來表示阻斷 40% 反應(yīng)的對照 OD 值。待測樣品OD 值 ＞ 臨界值，則判定結(jié)果為陰性孔；而如果待測樣品 OD 值≦臨界值的話，則表示為陽性孔。陽性孔最高的稀釋倍數(shù)就代表著該樣品的抗體效價，抗體效價＞1：16 判定抗體結(jié)果為合格。

1.3.2 口蹄疫抗體 O 型液相阻斷 ELISA

同樣嚴(yán)格按照試劑盒說明書開展相關(guān)操作，對于兩孔的平均OD 值進(jìn)行之后乘以 0.5，所得到的結(jié)果就代表著臨界值，表示阻斷 50% 反應(yīng)的對照 OD 值。待測樣品 OD 值 ＞ 臨界值，同樣表示陰性孔；而待測樣品的 OD 值如果≦臨界值的話，則意味著陽性孔，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)就是該樣品的抗體效價，豬血清抗體效價≧ 1 ∶ 64 顯示抗體合格。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)，使用（n，%）表示計數(shù)資料，組間差異以χ2、 t 檢驗進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過進(jìn)行檢測，對于其結(jié)果進(jìn)行分析，競爭 ELISA應(yīng)用于豬血清 O 型的檢測中，合格率為 91.7%；而液相 ELISA 的合格率也同樣為91.7%。對于豬血清 O 型抗體進(jìn)行的兩種方法檢測方法，其合格率符合度為 100%。

表1 兩種檢測方法對于豬 O 型口蹄疫免疫抗體的結(jié)果比較

基于抗體效價的整體結(jié)果而言，兩種檢測方式所得到的抗體效價不具有明顯的相關(guān)性，但是當(dāng)競爭 ELISA 測得的抗體效價≧1：180 的時候。兩種檢測方法中，競爭 ELISA 與液相 ELISA 的抗體效價為1：2。

3 討論

液相阻斷 ELISA 抗體檢測主要是采取雙抗體夾心法的模型，并將對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體，分別充當(dāng)為固相抗體、酶標(biāo)抗體。液相阻斷 ELISA 檢測方式主要是用于測定大分子抗原及對應(yīng)的抗體，而半抗原、小分子單價抗原及對應(yīng)的抗體則不適用，主要的原因是因為其并不能形成兩位兩位點夾心。在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)展，從而ELISA，所以ELISA是一種新型的免疫測定技術(shù)。其檢測過程為抗原吸附在固相載體上，加待測抗體，添加相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體，使其可以生成抗體-待測抗體- 酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，并與該酶的底物進(jìn)行有色反應(yīng)，然后通過利用酶標(biāo)儀的光吸收對于抗體的量進(jìn)行計算。

本研究使用將小分子抗原包被在酶標(biāo)板上的方法，并在檢測過程中加入待測樣本，使酶標(biāo)板上的抗原與樣本中的待測抗體進(jìn)行結(jié)合。然后添加HRP 酶標(biāo)記抗體，并且該抗體也能夠與酶標(biāo)板上抗體產(chǎn)生結(jié)合的作用，因為酶標(biāo)板上固定了一定數(shù)量的抗原之后，所以樣本中的抗體量越多，那么HRP 酶標(biāo)記抗體可以進(jìn)行結(jié)合的包被抗原將會越少。而兩種抗原競爭結(jié)合包被抗體，因此，被稱之為競爭法。

本次研究結(jié)果顯示，液相 ELISA 與競爭 ELISA 兩種檢測方法的抗體合格率所呈現(xiàn)出的結(jié)果為完全合格的狀態(tài)，并且對于同一血清的抗體效價進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，并無明顯的對應(yīng)關(guān)系。但是兩種檢測方式的敏感性、特異性均比較的高，試驗方法科學(xué)合理，試驗結(jié)果真實可靠。

本次檢測結(jié)果中，競爭 ELISA 的方法的抗體效價明顯低于液相 ELISA方法檢測樣品，原因可能是因為競爭 ELISA 方法所使用的結(jié)合抗原為口蹄疫病毒 VP1 結(jié)構(gòu)蛋白，而液相 ELISA則是采用口蹄疫全病毒，全病毒結(jié)構(gòu)含有蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白，其反應(yīng)程度要比競爭 ELISA 方法更強(qiáng)。但是，如果增加稀釋滴度的話，那么其抗原抗體反應(yīng)特異性將會更加的明顯，所以，受到客觀因素所產(chǎn)生的影響也將會更小，因此兩種檢測方法之間所獲得抗體效價對應(yīng)關(guān)系會逐漸的趨向于穩(wěn)定狀態(tài)。