潘雨薇，楊毓雯，黎昱材，羅瓊，柳建華

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院，廣州510180；2華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

缺血性心臟病是中高收入國家第一大致死性疾病。近幾十年來，溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)等措施在恢復(fù)患者心肌灌注方面起到良好效果。然而，恢復(fù)血供后有時會出現(xiàn)缺血部位結(jié)構(gòu)損傷和代謝障礙加重的現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。MIRI的基本特點包括：損傷的最終關(guān)鍵部位不是血細胞或血管壁，而是心肌細胞；損傷部位的病理改變伴隨著細胞膜的破裂；缺血再灌注損傷主要集中在再灌注開始后的前幾分鐘[2]。缺血再灌注誘導(dǎo)Ca2+爆發(fā)式釋放、活性氧大量生成和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放[3～5]。上述過程可對細胞膜產(chǎn)生破壞，其損傷作用包括細胞膜磷脂減少，細胞膜脆性增加，細胞膜上結(jié)合的酶活性下降，新的膜離子通道形成，使膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)或聚合，從而促進膜損傷、膜脂質(zhì)過氧化、磷脂酶活化及脂質(zhì)三聯(lián)體對膜結(jié)構(gòu)的破壞[6]。以上提示保護細胞膜可能是從下游減輕MIRI的方法之一。泊洛沙姆作為一類表面活性劑，是含有兩個聚氧乙烯和一個聚氧丙烯的非離子型三嵌段共聚物。其中泊洛沙姆188(P188)被認為具有較高安全性，同時它也是一種膜密封劑。既往研究顯示，P188能與二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二棕櫚酰磷脂酰甘油特異性結(jié)合，促進受損細胞膜的愈合[7]；P188也能顯著減輕細胞膜孔擴大，抑制碘化丙啶內(nèi)流[8]。目前，使用膜密封劑來減輕MIRI的相關(guān)研究較少。2017年3月～2019年1月，本研究觀察了P188對大鼠MIRI的干預(yù)作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量(250±20)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。細胞：新鮮SD大鼠尾靜脈血紅細胞。主要儀器：Logiq E9超聲影像系統(tǒng)、ALC-V9小動物呼吸機、BL-420生理記錄儀。主要試劑：戊巴比妥鈉、P188標準品、2,3,5-三苯四唑氯銨(TTC)、伊文思藍(EB)、大鼠超敏心肌肌鈣蛋白I(hs-cTnI)ELISA試劑盒、脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧尿苷缺口末端標記(TUNEL)凋亡試劑盒。本實驗方案經(jīng)華南理工大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(倫理編號2018027)。

1.2 P188對大鼠MIRI的干預(yù)作用觀察

1.2.1 MIRI模型建立及P188干預(yù) 15只大鼠隨機分為假手術(shù)組(SHAM組)、生理鹽水組(NS組)和P188組，每組5只。SHAM組僅開胸不進行冠狀動脈左前降支結(jié)扎。在NS組和P188組大鼠左心耳下方2 mm水平處用6-0縫線暫時性結(jié)扎左前降支使心肌變白、心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST-T段抬高。缺血30 min后，P188組經(jīng)尾靜脈注射15%的P188 250 mg/kg。NS組給予等量生理鹽水。隨后解開結(jié)扎處恢復(fù)灌注。以結(jié)扎水平下的心肌變白、心電圖ST-T段升高判定為MIRI模型制作成功。

1.2.2 心功能評價 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，進行超聲心動圖檢查。采用M模式，分別于結(jié)扎術(shù)前和再灌注2 h后記錄左心室縮短率(FS)和射血分數(shù)(EF)，計算術(shù)后與術(shù)前FS、EF的差值ΔFS、ΔEF。

1.2.3 心肌損傷標志物檢測 按ELISA試劑盒說明書操作，測定大鼠血漿hs-cTnI。

1.2.4 心肌組織觀察及梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比測定 維持麻醉，原位結(jié)扎大鼠心臟的左前降支。取大鼠動脈血3 mL置于肝素管中，左心室注射1.5%的EB 3 mL，靜置4 min。處死大鼠，取心臟速凍后切成5～6塊約2 mm厚的切片并將其浸泡于37 ℃的3% TTC中20 min。將心臟切片放入10%的中性甲醛溶液中固定15 min，拍照后用Image Pro Plus 6.0軟件分割圖像并計算梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比[9]。

1.2.5 心肌細胞凋亡率測算 將大鼠心臟切片，進行TUNEL染色，將切片脫蠟、修復(fù)、破膜后，加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和鳥苷三磷酸的混合物。孵育后，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行復(fù)染后封片。DAPI染色的細胞核在紫外光的激發(fā)下呈藍色，凋亡細胞核呈綠色。在熒光顯微鏡下采集圖像。采用Image Pro Plus6.0軟件分析并計算免疫熒光圖像中的凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.3 P188的細胞膜保護作用觀察

1.3.1 細胞分組及給藥方法 將大鼠尾靜脈血紅細胞分為7組，分別與PBS、不同濃度(1.88%、3.75%、7.5%、15%)的P188溶液、1%曲拉通X-100(Triton-X 100，一種經(jīng)典的快速裂解細胞組織的強破膜劑)溶液、含15% P188與1% Triton-X 100的混合溶液(即Triton+P188)共孵育。

1.3.2 相對細胞膜破裂率計算 各組紅細胞與200 μL對應(yīng)溶液在37 ℃恒溫振蕩箱中共孵育2 h，震蕩速度75次/min。離心后在541 nm波長下測定上清液的光密度(OD)值，計算相對細胞膜破裂率。

1.3.3 細胞形態(tài)觀察 各組紅細胞孵育2 h或12 h后在倒置顯微鏡下觀察拍照，觀察細胞形態(tài)。正常紅細胞在光鏡下可表現(xiàn)出良好的折光性。

2 結(jié)果

2.1 P188對大鼠MIRI的干預(yù)作用

2.1.1 各組大鼠心功能比較 NS組與P188組干預(yù)后均發(fā)生不同程度的左心室運動減弱。NS組、SHAM組、P188組ΔFS分別為-15.2%±4.4%、-0.2%±0.8%、-5.4%±4.3%，ΔEF分別為-14.4%±4.7%、-0.2%±0.8%、-4.7%±3.9%。NS組ΔFS、ΔEF低于SHAM組(P均<0.05)，但P188組與NS組、SHAM組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 各組大鼠超聲心動圖表現(xiàn)

2.1.2 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較 NS組、SHAM組、P188組大鼠血漿hs-cTnI水平分別為(640.8±60.6)、(302.4±42.1)、(460.7±25.9)pg/mL，P188組、SHAM組血漿hs-cTnI水平均低于NS組(P均<0.05)。

2.1.3 各組大鼠心肌梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比比較 各組大鼠心肌組織切面見圖2。P188組、NS組、SHAM組梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比分別為0.12±0.03、0.43±0.08、0，P188組梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比低于NS組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠心肌組織切面

2.1.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 NS組、SHAM組、P188組大鼠心肌細胞凋亡率分別為73.8%±5.9%、4.4%±1.6%、41.0%±7.1%，P188組、SHAM組心肌細胞凋亡率均低于NS組(P均<0.05)。

2.2 P188對紅細胞膜的保護作用

2.2.1 各組紅細胞相對細胞膜破裂率比較 15%及更低濃度的P188對細胞膜無明顯損傷。孵育2 h后，不含Triton的各組紅細胞基本未見破壞，Triton組紅細胞膜破壞最嚴重，Triton+P188組紅細胞膜破壞較輕。詳見圖3。PBS組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組相對細胞膜破裂率分別為0、-0.3±0.1、-0.3±0.0、3.4±0.0、11.2±0.8、100.0±0.0、6.5±0.1，孵育2 h后1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton+P188組相對細胞膜破裂率均低于Triton組(P均<0.05)。

注：A1～7分別為PSB組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組。

圖3 各組紅細胞膜破裂情況

2.2.2 各組紅細胞形態(tài)變化 孵育2 h后，不含Triton的各組均可見折光性好的完整細胞，Triton組未見完整細胞，Triton+P188組仍可見完整細胞。孵育12 h后，Triton+P188組中觀察不到完整的細胞，而PBS組仍能觀察到完整細胞。見圖4。

注：A1～7分別為PBS組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組孵育2 h后細胞形態(tài)；A8、A9分別為Triton+P188組、PBS組孵育12 h后細胞形態(tài)。

圖4 各組紅細胞形態(tài)變化

3 討論

細胞膜損傷是MIRI的重要機制之一，既往研究顯示P188可以幫助骨骼肌細胞在氧化環(huán)境中保持完整性，也可以作為細胞保護劑被加入到細胞培養(yǎng)基[10]。既往研究采用15%、250 mg/kg的P188進行體內(nèi)研究[11]，本研究在體內(nèi)沿用該P188濃度，另于體外實驗中設(shè)不同濃度組進行探究。本研究結(jié)果顯示，P188組心肌組織梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比、心肌細胞凋亡率及血漿hs-cTnI水平均低于NS組，表明P188有助于減輕大鼠MIRI，降低了缺血心肌細胞在再灌注過程中轉(zhuǎn)向死亡的可能。正常情況下，大部分線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔(mPTP)關(guān)閉。當(dāng)線粒體鈣超載時，線粒體膜電位降低，mPTP打開，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，加速線粒體凋亡相關(guān)因子的釋放，導(dǎo)致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴性和非Caspase依賴性細胞死亡。有研究表明，P188可降低Caspase-8、細胞色素C、Caspase-9的表達及凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的表達[12]。P188有可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的表達從而減輕MIRI[12,13]。不同于細胞凋亡率或梗死區(qū)與風(fēng)險區(qū)面積比，左心室心肌運動功能只有在心肌細胞功能顯著改善時才會發(fā)生明顯改變。本研究中，NS組與P188組ΔFS、ΔEF差異無統(tǒng)計學(xué)意義，暫無充分證據(jù)表明P188有改善心功能的作用，這可能與樣本量、選用的方法或其他原因有關(guān)[11,14]。

為進一步探討P188的作用機制，本實驗還觀察了P188對大鼠紅細胞膜的保護作用。已知P188通過進入細胞膜破裂處的外圍部分來修復(fù)細胞膜,這種現(xiàn)象以往只在模擬的生物膜中觀察到[7,15]。我們的實驗在細胞水平證實了P188可以直接使細胞抵抗強破膜劑的短期破壞作用。這種膜密封特性可能與P188特定的理化參數(shù)有關(guān)，如臨界膠束濃度、親水親脂平衡、表面活性劑膜/水分配系數(shù)或填料參數(shù)等，尤其是臨界膠束濃度。本研究中，在P188中孵育的紅細胞與PBS組的紅細胞表現(xiàn)相似，表明P188作用溫和，對細胞膜不會產(chǎn)生顯著損傷，不會引起明顯的細胞死亡。破膜劑TritonX-100作用迅速，可在數(shù)秒內(nèi)使幾乎所有的細胞膜發(fā)生破裂。P188的機械作用能夠使紅細胞在破膜劑孵育2 h后仍保持正常形態(tài)，這是由于P188的聚氧乙烯嵌段能投射到脂質(zhì)雙分子層兩側(cè)的水道中，幫助修復(fù)膜屏障。然而，在含P188與Triton X-100的溶液中孵育12 h后，鏡下觀察未見完整紅細胞，則表明P188修復(fù)破裂的細胞膜的能力是有限的，P188不能維持發(fā)生持續(xù)損傷的細胞膜的完整性。當(dāng)細胞膜產(chǎn)生的孔洞較小、直徑在0.2 μm以下時，細胞膜的脂質(zhì)雙分子層的斷裂端可在自由能作用下再次融合，細胞膜因此修復(fù)。當(dāng)細胞膜產(chǎn)生的孔洞較大時，需要激活細胞內(nèi)源性的修復(fù)機制，胞內(nèi)小囊在肌球蛋白與驅(qū)動蛋白的作用下轉(zhuǎn)移到細胞膜缺損處，進行細胞膜修復(fù)。當(dāng)細胞膜破裂過大時，P188無法通過單純的機械作用來修復(fù)細胞膜，最終導(dǎo)致細胞膜損傷。

P188是一種可靜脈注射材料，具有高度的生物相容性，能防止被巨噬細胞攝取，待生物膜愈合后還可被“擠出”膜結(jié)構(gòu)[16]。P188在眼組織、生殖系統(tǒng)和肝臟中應(yīng)用具備一定的安全性。在體內(nèi)，P188濃度較高的組織依次為腎臟、淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、膀胱和胃腸道。在大鼠、狗和人體內(nèi)，P188的清除幾乎完全是通過腎臟以原型排出[17～20]。我們發(fā)現(xiàn)，P188可導(dǎo)致大鼠腎近曲小管細胞輕度腫脹伴空泡變性，但未見明顯壞死征象。鑒于上述實驗結(jié)果，我們認為，盡管P188是眾多表面活性劑中安全性很高的一種，但濃度為15%、劑量為250 mg/kg的P188對大鼠腎臟仍有一定程度的損害。

綜上所述，P188可減少缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死面積及心肌細胞凋亡率、降低hs-cTnI水平，減輕心肌損傷；其對心功能無明顯改善作用，且對腎近曲小管細胞有一定損傷。P188減輕MIRI的機制與其細胞膜穩(wěn)定作用有關(guān)，但P188不能逆轉(zhuǎn)持續(xù)破壞作用下導(dǎo)致的細胞膜破裂。