劉志朝，楊佳，王莉，強梅

(山西醫(yī)科大學，太原030001)

遺傳印記又稱基因組印記，是指子代中特定基因、基因簇僅表達父源或母源的等位基因，而另一側親本等位基因沉默的可遺傳表觀修飾現(xiàn)象[1]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調控等。DNA甲基化與男性不育、胚胎發(fā)育的關系已成為生殖與發(fā)育領域的研究熱點。有學者[2]發(fā)現(xiàn)，精子DNA全基因組高甲基化組的配偶受孕率明顯高于低甲基化組。H19為位于人染色體11p15.5的父系印記基因，大量研究表明精子H19基因低甲基化與男性不育有關[3]。Peg3是位于人染色體19q13.4、小鼠7號染色體近端的母系印記基因。Meg3是位于人染色體14q32.3、小鼠12號染色體遠端的父系印記基因。敲除印記基因Peg3或Meg3的小鼠出現(xiàn)胚胎生長受限或死亡[4,5]，Peg3、Meg3甲基化可能與胚胎發(fā)育有關。有研究認為，在成熟精子中，與胚胎生長發(fā)育密切相關的基因啟動子甲基化水平低，而DNA甲基化異常會導致胚胎異常發(fā)育和生長[6]。但多數(shù)相關研究受樣本量較少限制，不易對混雜因素予以控制。因此，筆者開展了較大樣本量研究，觀察不同年齡、BMI、吸煙和飲酒狀況等一般人口學特征的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平的分布情況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年3～4月和2016年3～4月于山西省婦幼保健院生殖中心男科進行孕前檢查的已婚男性(年齡22～60歲)納入研究。排除家族有遺傳病史、不育史者，精液過少者(<0.5 mL)。所有參與研究人員均簽署知情同意書。自行設計結構式問卷，內容包括人口學特征、生活習慣、既往病史和心理健康狀況等，由培訓合格的調查員進行面對面調查。其中吸煙為平均每日吸煙1支或以上，持續(xù)1年以上；飲酒為平均每周至少飲酒1次，每次100 g或以上，持續(xù)1年以上。共有702人配合填寫問卷，其中605人提供精液樣本，共成功獲得440人的DNA甲基化檢測結果。440人中，年齡22～58歲，<30歲192人(43.6%)、30～34歲167人(38.0%)、35～39歲53人(12.0%)、>39歲26人(5.9%)；BMI 17.1～38.4，<18.5(體質量偏低)12人(3.4%)、18.5～23.9(正常)168人(38.2%)、24.0～27.9(超重)152人(34.5%)、≥28(肥胖)104人(23.6%)；吸煙233人(53%)、不吸煙203人(46.1%)、缺失4人；飲酒128人(29.1%)、不飲酒308人(70%)、缺失4人。缺失為問卷資料填寫不完整。問卷各項目缺失情況不重疊。

1.2 精子DNA甲基化水平檢測

1.2.1 精子DNA提取 研究對象禁欲3～7 d，手淫法收集全程精液，-80 ℃保存。用胍硫氰酸鹽沉淀法提取精子DNA。于1.5 mL的EP管中加入樣品200 μL和PBS緩沖液1 000 μL，混勻后1 500 g冷凍離心10 min，共清洗3次，以清除細胞外的物質；棄上清，加裂解液500 μL，55 ℃水浴12 h；取出水浴的EP管，冷卻至室溫，加RNA酶10 μL，混勻，室溫孵育10 min；加等體積異丙醇，顛倒10次，16 000 g離心10 min；棄上清，加75%乙醇800 μL于EP管中，顛倒10次，16 000 g離心10 min，放置于-20 ℃數(shù)小時；再清洗1次后棄上清，待乙醇自然揮發(fā)干；加E5 30 μL于EP管中，65 ℃水浴2 h使DNA充分溶解。檢測DNA濃度和純度，取濃度大于50 ng/μL、A260/A2801.7～2.0的DNA樣本。

1.2.2 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 使用EZ Methylation Gold-Kit試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說明書對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。在20 μL的DNA提取液(1 000 ng DNA)中加入130 μL的CT轉換試劑，放置于PCR儀上，進行加熱變性；冷卻后將其添加至含有600 μL M-Binding Buffer的Zymo-SpinTM柱子中，10 000 g離心30 s；柱子中加入100 μL的M-Wash Buffer清洗，10 000 g離心30 s；加入200 μL的M-Desulphonation Buffer，室溫孵育15 min，10 000 g離心30 s；加入200 μL的M-Wash Buffer，10 000 g離心30 s，清洗2次；分2次共加入15 μL的M-Elution Buffer，10 000 g離心30 s，以洗脫附著在柱子膜上的DNA。取濃度>30 ng/μL、A260/A280>1.9的DNA進行后續(xù)實驗。

1.2.3 H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平檢測 用PyroMark PCR Kit試劑盒對進行PCR擴增；再經(jīng)單鏈PCR產(chǎn)物純化、測序引物雜交等步驟后使用PSQ96焦磷酸測序儀及PyroMark Gold Q96 Kit試劑盒對H19、Peg3、Meg3基因的目的片段進行甲基化水平的檢測。測序過程參考文獻[7]。每個基因甲基化差異區(qū)(DMR)分析的CpGs位點數(shù)目∶H19基因7個，Meg3基因8個，Peg3基因7個。PCR引物序列見表1。

表1 H19、Meg3、Peg3基因的DMR區(qū)正向、反向引物及測序引物序列(5′→3′)

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。采用K-S檢驗進行正態(tài)性檢驗，除H19基因的CpG3位點數(shù)據(jù)外(P=0.2)，其余各印記基因位點數(shù)據(jù)均不服從正態(tài)分布(P<0.05)，因此以中位數(shù)描述數(shù)據(jù)。不同年齡、BMI者基因甲基化水平比較采用Kruskal-WallisH檢驗，對有差異的項目通過Nemenyi檢驗進行兩兩比較；不同吸煙、飲酒情況者基因甲基化水平比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同人口學特征者H19基因各CpG位點甲基化水平比較 H19基因甲基化數(shù)據(jù)缺失1例。不同年齡、BMI、飲酒情況者H19基因各CpG位點甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義。吸煙者H19基因CpG2、CpG7位點甲基化水平高于非吸煙者(P均<0.05)，去除極端值后差異仍有統(tǒng)計學意義(CpG2位點數(shù)據(jù)去除0個，CpG7位點數(shù)據(jù)去除1個，P=0.043)。詳見表2。

表2 不同人口學特征者H19基因各CpG位點甲基化水平比較(%)

2.2 不同人口學特征者Peg3基因各CpG位點甲基化水平比較 不同年齡、BMI、吸煙情況、飲酒情況者Peg3基因各CpG位點甲基化水平差異均無統(tǒng)計學意義。詳見表3。

表3 不同人口學特征者Peg3基因各CpG位點甲基化水平比較(%)

2.3 不同人口學特征者Meg3基因各CpG位點甲基化水平比較 不同年齡、飲酒情況者Meg3基因各CpG位點甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義。不同BMI者Meg3基因CpG8位點甲基化水平差異有統(tǒng)計學意義，進一步組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義;其余CpG位點甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義。吸煙者Meg3基因CpG2位點甲基化水平高于與非吸煙者(P=0.035)，去除7個極端值后組間比較仍有統(tǒng)計學差異(P=0.014)。詳見表4。

表4 不同人口學特征者Meg3基因各CpG位點甲基化水平比較(%)

3 討論

目前精子DNA甲基化在男性不育、不良妊娠結局的表觀遺傳機制相關研究中逐漸受到重視，但類似機制研究樣本量普遍較少，因此筆者進行了較大樣本量研究來描述不同人口學特征男性精子印記基因甲基化的分布情況，以期為相關研究控制混雜因素提供理論基礎。

有學者[8]發(fā)現(xiàn)隨年齡增長精子DNA有138個區(qū)域的甲基化水平降低，8個區(qū)域甲基化水平增高。該研究者進一步比較47名平均年齡為20.46歲的青年男性與19名平均年齡為47.71歲的男性精子DNA 15個區(qū)域的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)組間仍有差異，因此認為年齡與這些基因組位點的甲基化改變有關[8]。有學者[9]檢測了精子DNA中9個印記基因的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其中有4個基因甲基化水平與年齡相關。但本研究并未發(fā)現(xiàn)不同年齡組精子H19、Peg3、Meg3基因DMR區(qū)域各CpG位點甲基化水平的差異。分析原因：本研究所涉及的精子3個印記基因的甲基化水平可能不隨年齡的增長而變化；本研究高年齡組平均年齡較低(43.19歲)，可能導致了結果的差異。

Soubry等[10]對46例BMI正常男性和23例超重或肥胖男性精子印記基因甲基化水平進行比較，發(fā)現(xiàn)超重或肥胖組精子Meg3、NDN、SNRPN、Peg10基因甲基化水平降低；而Meg3-IG、H19基因甲基化水平升高。但另一項對3只肥胖小鼠和3只對照小鼠精子的研究發(fā)現(xiàn)，H19、IGF2、Meg3-IG、IGF2R、MEST、Peg3、NNAT、SNRPN基因的DMR甲基化水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變[11]。本研究也未發(fā)現(xiàn)BMI正常、體質量偏低、超重和肥胖男性精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化的差異。本研究的數(shù)據(jù)支持男性BMI與精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平無關。

有研究稱吸煙可造成精子基因組甲基化水平升高[12]。一項對21名吸煙男性和57名不吸煙男性的研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA中141個CpG位點甲基化水平與吸煙有關[12]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，吸煙男性精子H19基因的CpG2、CpG7位點和Meg3基因的CpG2位點甲基化水平升高。多項研究表明，吸煙與男性不育有關[13]，且H19基因甲基化的改變與精液參數(shù)相關[14]。印記基因甲基化水平升高會使其表達水平降低[15]?，F(xiàn)已證實腫瘤細胞中H19、Meg3高表達，胚胎發(fā)育過程中H19高表達[16]，精子生成過程中也有類似的細胞增殖的過程。因此，結合本研究的結果，筆者推測吸煙可能導致精子H19、Meg3基因甲基化水平升高而降低二者的表達水平，從而降低精液質量。

研究報道，雌鼠孕期10～18 d口服乙醇，F(xiàn)1代小鼠精子H19基因CpG島甲基化水平相比對照組降低了3%，Gtl2、Peg1、Snrpn、Peg3基因甲基化與對照組無統(tǒng)計學差異[17]。一項研究發(fā)現(xiàn)，中度飲酒組H19基因第7個CpG位點甲基化水平與不飲酒組、重度飲酒組有統(tǒng)計學差異，重度飲酒組Ig-DMR甲基化水平與其他兩組有統(tǒng)計學差異[18]。飲酒對精子印記基因甲基化的影響尚無定論。本研究的數(shù)據(jù)也提示，不同飲酒狀況的人群中，精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平無統(tǒng)計學差異。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同年齡、BMI和飲酒情況的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平無統(tǒng)計學差異；有吸煙習慣的男性精子H19基因的CpG2、CpG7位點和Meg3基因的CpG2位點甲基化水平高于非吸煙者。下一步將有針對性地探討不同印記基因甲基化水平的影響因素，并在可能的條件下通過隊列研究探討印記基因甲基化水平與不孕不育的關系。