程 瑋 于恒智* 牛文博 湯國謙

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)校，遼寧錦州 121007；2.錦州海關(guān)，遼寧錦州 121001；3.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東東莞 523000）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100%。近年來，亞洲的人狂犬病每年約有3.5萬例，約占全世界總數(shù)的98%。自建國以來，我國死于狂犬病的人數(shù)約10萬人，其中2004年死亡2651例，其病死率在所有傳染病中居首位。因此，開展對犬狂犬病診斷預(yù)防的研究具有重要的社會意義。

單克隆抗體因其具有高度的同質(zhì)性和特異性成為了檢測病原和抗體的最佳生物探針，加之可以批量生產(chǎn)，易于標(biāo)準(zhǔn)化，使其在病毒血清學(xué)鑒定及診斷治療方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究旨在利用雜交瘤技術(shù)制備抗RV單克隆抗體，篩選與RV有高度親和力和中和活性的單抗作為診斷試劑，同時也為新型疫苗的研制、流行病學(xué)研究及抗體人源化等方面的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑：RabvacTM3購自美國富道動物保健有限公司；人用狂犬病疫苗購自大連金港安迪生物制品有限公司；HAT、HT選擇培養(yǎng)基、PEG、HRP-山羊抗鼠IgG均為Sigma公司產(chǎn)品；FITC-羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動物與毒種：BHK-21細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室凍存。雌性BALB/c小鼠和昆明白鼠購于衛(wèi)生部長春生物制品所；CAV-2-CGS重組毒和CVS株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA和IFA檢測方法的建立：具體方法按文獻(xiàn) [2]進(jìn)行。

1.2.2 單克隆抗體的制備：用RabvacTM3腹腔注射6周齡BALB/c小鼠，0.2ml/只，兩周后以同樣方法進(jìn)行第二次免疫；隔周以人用狂犬病疫苗進(jìn)行第三次免疫。加強(qiáng)免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選、亞克隆、McAb的大量制備，以上實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)[2-4]進(jìn)行。

1.2.3 腹水的純化：采用辛酸-飽和硫酸銨法對制備的單抗腹水進(jìn)行純化[5]。

1.2.4 Western blot分析：將純化的RV進(jìn)行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)印，4℃封閉過夜。洗好膜后

加入以封閉液 1：1000倍稀釋的小鼠腹水200ul，室溫振蕩孵育1h，加入HRP-羊抗鼠IgG和底物液，室溫顯色。

1.2.5 相加ELISA：測定兩種純化單抗是否識別相同的抗原位點(diǎn)，具體測定方法按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞系的建立及其培養(yǎng)上清和腹水效價的測定 經(jīng)ELISA和IFA篩選和亞克隆，獲得2株陽性雜交瘤細(xì)胞，命名為1G8、4G11。間接ELISA測定其培養(yǎng)上清及腹水效價（見表1）。

表1 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價

2.2 腹水單抗飽和值測定 經(jīng)間接ELISA測定，2株陽性雜交瘤細(xì)胞腹水抗體的飽和度均為1：103（以O(shè)D490nm值明顯降低的前一個稀釋度作為單抗飽和濃度值）。

2.3 腹水單抗的純化 純化后的1G8、4G11腹水的蛋白含量分別為1.78和1.00 mg/mL，SDS-PAGE鑒定其純度，大約在50KD和25KD處分別可見IgG重鏈和輕鏈兩條特異性條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 SDS-PAGE鑒定純化的1G8，4G11腹水單抗

2.4 單抗特異性鑒定

2.4.1 ELISA檢測兩株單抗與CVS和CAV-2-CGS的反應(yīng)性：陽性對照為融合前制備的小鼠高免血清，陰性對照為SP2/0細(xì)胞上清，結(jié)果見表2

表2 間接ELISA檢測2株單抗與CVS和CAV-2-CGS的反應(yīng)性

2.4.2 IFA檢測兩株單抗與RV的反應(yīng)性：將兩株單抗分別與感染CVS的BHK-21細(xì)胞和感染CAV-2-CGS的DK細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

C、D：感染CVS的BHK-21細(xì)胞分別與1G8、4G11腹水的反應(yīng)結(jié)果；G、H：感染CAV-2-CGS的DK細(xì)胞分別與1G8、4G11腹水的反應(yīng)結(jié)果

圖2 IFA檢測兩株單抗與CVS和CAV-2-CGS的反應(yīng)結(jié)果

2.5 Western blot分析 單克隆抗體1G8與RV呈現(xiàn)特異反應(yīng)條帶，結(jié)果見圖3。結(jié)合間接ELISA和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析表明它所針對的抗原表位為線性表位。

圖3 純化的RV對2株單抗進(jìn)行SDS- PAGE和Western blot分析結(jié)果1.蛋白Marker；4、5 1G8和4G11的Western-Blot分析圖

2.6 單克隆抗體抗原識別位點(diǎn)分析 經(jīng)相加ELISA測定，1G8和4G11兩株單克隆抗體兩兩疊加后的AI值為16.8%，說明它們分別識別不同的抗原表位。

3 討論

制備的單抗1G8在相對分子質(zhì)量67000（RV糖蛋白相對分子質(zhì)量大?。┨幊霈F(xiàn)了明顯條帶。由于經(jīng)過SDS的作用轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的蛋白是變性的，若糖蛋白中單抗識別的抗體表位在Western blot中并未被破壞，提示這個表位的結(jié)構(gòu)是線性的。因此，McAb 1G8與RV糖蛋白抗原發(fā)生反應(yīng)，其識別的表位是線性的，而不是針對空間表位的。在實(shí)驗(yàn)過程中獲得的大多數(shù)McAb，都不與變性G蛋白發(fā)生反應(yīng)，也證實(shí)大多數(shù)針對糖蛋白的McAb是識別空間表位，而不是識別線性表位的這一結(jié)論。

本研究獲得的針對RV糖蛋白的單克隆抗體，經(jīng)生物學(xué)特性鑒定，具有效價高、特異性好的特點(diǎn)，可標(biāo)記為指示性抗體，并為建立狂犬病病毒的競爭ELISA方法提供有力的技術(shù)支持，為我國狂犬病病毒的防制及抗體人源化等方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)。