薛麗 張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

目前，抗生素是臨床牙周病治療的常用藥物，但長(zhǎng)期服用抗生素不僅容易產(chǎn)生耐藥性，而且會(huì)進(jìn)一步加重口腔菌群紊亂、促進(jìn)疾病發(fā)展[1]。人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)和牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)是牙周組織的主要細(xì)胞類(lèi)別[2]。研究表明，牙周組織感染的細(xì)菌裂解后釋放脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可作用于HGFs與HPDLCs細(xì)胞膜上模式識(shí)別受體Toll 樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)，從而激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多種炎癥因子的表達(dá)，介導(dǎo)牙周組織的炎癥反應(yīng)和損傷，促進(jìn)牙周病的發(fā)生發(fā)展[3]。因此，建立體外原代的HGFs與HPDLCs細(xì)胞模型，篩選干預(yù)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的有效天然產(chǎn)物，可望為進(jìn)一步研發(fā)安全有效的牙周病防治健康產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

美洲大蠊(Periplanetaamericana L．)，屬于昆蟲(chóng)綱蜚蠊科蜚蠊亞目，俗稱(chēng)“蟑螂”，其藥用歷史悠久，可用于治療兒童疳積、扁桃腺炎、癰瘡腫痛等。近年來(lái)，人們對(duì)美洲大蠊的研究日益增多，研究結(jié)果顯示美洲大蠊具有促進(jìn)傷口愈合、抗肝炎、抗?jié)?、提高免疫力等多種藥理活性[4-8]；肖小芹等[9]報(bào)道美洲大蠊提取物(periplanetaamericana extract，PAE)具有顯著的抗炎活性，可抑制小鼠耳廓炎性腫脹和大鼠足跖炎性腫脹。目前，PAE對(duì)牙周病的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在從細(xì)胞水平探討PAE對(duì)LPS誘導(dǎo)的2 種人源牙周病細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)的影響及潛在的作用機(jī)制，以期為牙周病的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物來(lái)源

人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞源于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院；PAE源于云南白藥集團(tuán)股份有限公司。

1.2 試劑

LPS(E. coli O55:B5)(Sigma公司,美國(guó))；DMSO、MTT、青霉素和鏈霉素(Amresco公司,美國(guó))；α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國(guó))；胎牛血清(北京民海生物科技有限公司)；IL-6 ELISA試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔NF-κB-p65單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗MMP2多克隆抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；兔抗TLR4單克隆抗體、羊抗兔FITC、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor's蘇木素(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的原代HPDLCs和HGFs復(fù)蘇，用α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶3傳代，選取4～8 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將HGFs和HPDLCs隨機(jī)分為對(duì)照組，LPS組(1 μg/ml LPS)和PAE干預(yù)組。其中HGFs細(xì)胞所用PAE藥物濃度分別為0. 5、1和2 mg/ml(PAE-0.5組，PAE-1組，PAE-2組)，HPDLCs細(xì)胞所用PAE藥物濃度分別為0.05、 0.1和 0.2 mg/ml PAE(PAE-0.05組，PAE-0.1組，PAE-0.2組)。

1.5 MTT法測(cè)定PAE對(duì)細(xì)胞活性的影響

將細(xì)胞懸浮液 (1×104個(gè)/孔) 接種于96 孔板，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，按分組給藥，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，24 h后，每孔加入10 μl(5 mg/ml)MTT ，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，常溫下震蕩10 min。于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A490/空白組A490×100%)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 ELISA法測(cè)定IL-6含量

將生長(zhǎng)良好的HGFs和HPDLCs(1×104個(gè)/孔)接種于96 孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按分組給藥，每組設(shè)9 個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-6含量。

1.7 免疫染色法測(cè)定TLR4、MMP2的表達(dá)及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況

將生長(zhǎng)良好的HGFs和HPDLCs(1.5 ×104個(gè)/孔)接種于含細(xì)胞爬片的24 孔板，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行TLR4、MMP2和NF-κB-p65的免疫染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察TLR4、MMP2的陽(yáng)性表達(dá)及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PAE對(duì)HGFs和HPDLCs細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，LPS組、PAE干預(yù)組HGFs(表 1)和HPDLCs(表 2)細(xì)胞活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

組別LPS濃度(μg/ml)PAE濃度(mg/ml)細(xì)胞存活率(%)對(duì)照組——100.0±3.6模型組1—101.0±3.5①PAE-0.510.5106.0±3.2①PAE-111105.6±3.2①PAE-212103.1±1.6①

注： ①與對(duì)照組比較，P>0.05

組別LPS濃度(μg/ml)PAE濃度(mg/ml)細(xì)胞存活率(%)對(duì)照組——100.0±2.7模型組1—101.4±1.8①PAE-0.0510.05103.8±1.5①PAE-0.110.1102.4±2.4①PAE-0.210.2101.2±6.2①

注： ①與對(duì)照組比較，P>0.05

2.2 PAE對(duì)IL-6含量的影響

與對(duì)照組相比，LPS組IL-6含量顯著增高，表明LPS誘導(dǎo)可引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。與LPS組相比，PAE干預(yù)組HGFs中IL-6含量呈濃度依賴(lài)性的下降，其中PAE-2組(2 mg/ml)顯著下降(A)；PAE干預(yù)組HPDLCs中IL-6含量呈濃度依賴(lài)性顯著下降(B)，表明PAE抑制牙齦成纖維細(xì)胞(A)和牙周膜細(xì)胞(B)IL-6的分泌(圖 1)。

圖 1 PAE抑制人牙齦成纖維細(xì)胞(A)和牙周膜細(xì)胞(B)IL-6的生成

2.3 PAE對(duì)TLR4與MMP2蛋白表達(dá)的影響

如圖 2，與對(duì)照組相比，LPS組的TLR4和MMP2陽(yáng)性表達(dá)顏色較深，表明LPS組的TLR4和MMP2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與LPS組相比，PAE-2組(2 mg/ml)和PAE-0.2組 (0.2 mg/ml) TLR4和MMP2陽(yáng)性表達(dá)顏色明顯變淺，提示PAE能有效抑制TLR4和MMP2的蛋白表達(dá)。

2.4 PAE對(duì)NF-κB活化的影響

如圖 3，對(duì)照組NF-κB-p65基本分布在胞漿中，LPS組NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)明顯增多，PAE-2組(2 mg/ml)和PAE-0.2組(0.2 mg/ml)NF-κB-p65的核內(nèi)轉(zhuǎn)明顯減少，提示PAE能有效抑制NF-κB活化。

圖 2 PAE對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞TLR4和MMP2蛋白表達(dá)的影響 (免疫組化， ×200)

Fig 2 The effects of PAE on the expression of TLR4 and MMP2 in HGFs and HPDLCs (IHC， ×200)

3 討 論

牙周病是常見(jiàn)的口腔炎癥性疾病，其主要致病因子是革蘭氏陰性菌的LPS[3]。研究表明，大腸桿菌的LPS與牙周病致病菌牙卟啉單胞菌和伴放線(xiàn)菌聚集菌共享宿主細(xì)胞反應(yīng)的生物活性，引發(fā)炎癥反應(yīng)[10-11]。牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞是牙周組織的主要細(xì)胞群，在牙周組織的再生和修復(fù)中起重要作用[2]。在正常狀態(tài)下，二者能夠合成、分泌少量的膠原酶和其他金屬蛋白酶，維持細(xì)胞外基質(zhì)。在病理狀態(tài)下，HGFs和HPDLCs被炎癥介質(zhì)激活，合成及分泌MMPs和炎癥因子增加，促使細(xì)胞外基質(zhì)降解[2]。研究表明，與正常人相比，牙周病患者牙周組織中MMP2、IL-6等的表達(dá)顯著增加[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌的LPS來(lái)刺激HGFs和HPDLCs建立牙周病體外細(xì)胞模型，探討PAE對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGFs和HPDLCs炎癥反應(yīng)的作用及潛在作用機(jī)制。

圖 3 PAE對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞NF-κB活化的影響 (免疫熒光技術(shù)， ×400)

Fig 3 The effects of PAE on the activation of NF-κB in HGFs and HPDLCs (Immunofluore scence, ×400)

TLR4是LPS的第一模式識(shí)別受體[3]，不僅存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，還存在于牙周組織的牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞等非免疫細(xì)胞表面[2]。LPS與細(xì)胞膜TLR4結(jié)合后，通過(guò)一系列磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)，通過(guò)與核內(nèi)下游靶基因結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)IL-6等細(xì)胞因子和MMP2等基質(zhì)金屬蛋白酶的炎癥表達(dá)[13-14]。研究表明，LPS刺激30 min到1 h后，可激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路的炎癥反應(yīng)[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇LPS作用1 h后，檢測(cè)TLR4 /NF-κB信號(hào)通路及炎癥介質(zhì)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組TLR4與MMP2表達(dá)、NF-κB-p65活化及IL-6的產(chǎn)生明顯增多，PAE-2和PAE-0.2組TLR4與MMP2表達(dá)、NF-κB-p65活化及IL-6的產(chǎn)生明顯減少。

綜上所述，PAE可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制IL-6的分泌，下調(diào)MMP2表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。目前，以PAE為有效成分的上市藥物主要包括康復(fù)新、肝龍膠囊、心脈隆注射液等，分別用于潰瘍性結(jié)腸炎、乙型肝炎及心衰的治療。本研究結(jié)果為PAE應(yīng)用于牙周病防治提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。值得注意的是，PAE對(duì)HGFs和HPDLFs 2 種牙周病細(xì)胞模型的有效劑量分別是2 mg/ml和0.2 mg/ml，表明HGFs和HPDLFs對(duì)PAE的敏感性存在差異。因此，PAE用于在牙周病防治的量效關(guān)系還需開(kāi)展體內(nèi)有效性研究。