程鵬飛

（大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理 671003）

野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降血壓、清除氧自由基、增加冠脈血流量、抗動脈粥樣硬化、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用，不僅被用于風(fēng)熱感冒、肺炎、口瘡、癰疽等疾病的治療，而且在治療心血管疾病、腦供血不足、早期神經(jīng)退行性病變和調(diào)節(jié)血脂水平等方面也有良好的療效，在中獸醫(yī)療法中也被廣泛應(yīng)用[1]。野菊花化學(xué)成分復(fù)雜，其品質(zhì)和制劑品質(zhì)的評定沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，過量服用野菊花也會有一定的毒副作用，黃酮類化合物是野菊花的主要藥效成分[2]，將野菊花黃酮制備成脂質(zhì)體不僅可以提高療效，降低其毒副作用，還可以較好的控制脂質(zhì)體制劑的質(zhì)量和藥用劑量[3]。因此，野菊花黃酮脂質(zhì)體有很好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 試劑與儀器

1.1 藥材與試劑

野菊花：購于楊凌華仁堂大藥房；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號100080-200707），中國藥品生物制品檢定所；大豆磷脂（批號20140304），上海太偉藥業(yè)有限公司；膽固醇（批號F20140312），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；魚精蛋白（批號20140930-1020A022）Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

PL-2002型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-3802H紫外-可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TGL-16S型臺式高速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；BSA224S-CW型電子天平等。

2 方法

2.1 野菊花黃酮提取、分離和純化

采用乙醇回流法提取，聚酰胺樹脂分離和純化[1]；制備了3批黃酮樣品，置于-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配置

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品24.4mg，加適量60%乙醇充分溶解，轉(zhuǎn)入100 ml的容量瓶中，用60%乙醇定容，即配置成0.244mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取1.3334g的 AlCl3，用適量60%乙醇溶解，并定容至100ml，即配置成0.1mol/L的AlCl3溶液。分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml于25ml的容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再用60%的乙醇定容，搖勻，靜置20min；以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白最照，在波長415nm處測定吸光度值[1]，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得吸光度的值與濃度的關(guān)系列于表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度值

得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=31.455X-0.0093，R2=0.9991（圖1），式中Y為溶液在415nm處的吸光度，X為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光曲線

2.2.3 樣品黃酮含量測定

分別于3批樣品中取樣0.0046g、0.0052g、0.0081g，用適量60%乙醇充分溶解，置于25 ml容量瓶中，各加入0.1mol/L 的AlCl3溶液1ml，再加60%乙醇溶液定容，測量吸光度值，并帶入曲線計(jì)算得到3批樣品黃酮含量分別為10.9%、10.4%、11.2%。樣品平均黃酮含量為10.83%。

2.3 野菊花黃酮脂質(zhì)體制備試驗(yàn)

2.3.1 BBD響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)

脂藥比、膜材比、超聲時(shí)間是野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率的主要影響因素，以此3個因素為自變量，每個因素選擇3個水平（如表2），以脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)。

表2 野菊花黃酮脂質(zhì)體制備工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

采用響應(yīng)面軟件（Design-Expert 7.1.6）中的Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算出每一組試驗(yàn)中脂質(zhì)體的包封率，并用該軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出最佳的制備條件組合。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

2.3.2 野菊花黃酮脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法[4]結(jié)合超聲輔助法，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別稱取卵磷脂、膽固醇和野菊花黃酮樣品粉末，用10ml無水乙醇和10ml氯仿充分溶解，然后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在燒瓶內(nèi)壁形成薄膜，加入PBS液20ml，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)至膜完全溶解，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間進(jìn)行超聲處理，再分別過0.45μm和 0.22μm的微孔濾膜，即制成野菊花黃酮脂質(zhì)體。

2.3.3 脂質(zhì)體包封率的測定

吸取野菊花黃酮脂質(zhì)體0.5ml于1ml錐形離心管中，加入0.5ml魚精蛋白（10mg/ml）混勻，過夜，在4℃下，13000rpmin離心25min，吸取上清液于25ml的容量瓶中，加入0.1mol/L的AlCl3溶液1ml，再用60%乙醇溶液定容，按上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)法測定其吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算得黃酮含量，即游離藥物量[4]。脂質(zhì)體包封率按照下列公式計(jì)算：

η=（C總-C游）/C總×100%

式中：η為脂質(zhì)體包封率；C總為脂質(zhì)體懸液中包封黃酮量與游離黃酮量之和；C游為游離黃酮含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表3，對結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合，得到野菊花黃酮脂質(zhì)體的包封率對脂藥比（A）、膜材比（B）、超聲時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=76.32-5.50A+8.16B-2.31C+4.58AB-1.72AC+2.70BC-8.94A2-20.91B2-5.61C2

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用該軟件對結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，并對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，模型P=0.0005＜0.01，表示模型極顯著，說明該模型成立，本實(shí)驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)P=0.7092＞0.05，不顯著，表明該回歸方程擬合度較好，沒有失擬因素存在。進(jìn)一步說明在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以用來解釋和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。模型中的B、A2、B2對野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率的影響極顯著，A、AC、C2對野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率的影響顯著，同時(shí)結(jié)合F值的大小，可以知道B（膜材）比對野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率影響最大，其次是A（脂藥比），即膜材比＞脂藥比＞超聲處理時(shí)間。

表4 響應(yīng)面方差分析

3.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

利用 Box-Behnken模塊可以做出以兩兩自變量為坐標(biāo)軸的3D圖和等高線圖（圖2、圖3，以脂藥比和膜材比為例，固定水平為超聲時(shí)間20min，A為脂藥比，B為膜材比，R1為包封率），這些圖不僅可以很好地揭示每個自變量對因變量的影響程度，也能直觀地反映自變量之間的交互作用。

圖2 脂藥比和膜材比響應(yīng)曲面

圖3 脂藥比和膜材比等高線圖

通過該軟件模型對野菊花黃酮脂質(zhì)體的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)條件為脂藥比9.49：1，膜材比8.32：1，超聲處理時(shí)間18.71min。為了操作方便，將最優(yōu)條件調(diào)整為脂藥比9.5：1，膜材比8.0：1，超聲處理時(shí)間19min。在此條件下制備的野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率為77.82%。通過3組試驗(yàn)驗(yàn)證，分別測得包封率為77.69%、76.98%和76.86%，重現(xiàn)性較好。

4 結(jié)論

目前制備野菊花黃酮脂質(zhì)體的方法主要有薄膜分散法、乙醇注入法和超聲法等，本試驗(yàn)采用薄膜分散法結(jié)合超聲輔助法，來制備野菊花黃酮脂質(zhì)體。與乙醇注入法相比，薄膜分散法結(jié)合超聲處理制備得到的脂質(zhì)體粒徑均勻，多為單室脂質(zhì)體[1]。但是，薄膜分散法在減壓蒸發(fā)，形成薄膜的終點(diǎn)難以確定，有機(jī)溶劑蒸發(fā)速度過快等，都將導(dǎo)致制成的脂質(zhì)體粒徑不均一，包封率低。正交試驗(yàn)雖然能處理離散的水平值，并且能精確到某一個具體的點(diǎn)，但其無法找出整個范圍內(nèi)因素的最優(yōu)值及最佳組合條件[5]，響應(yīng)面法克服了此缺點(diǎn)。采用響應(yīng)面法，通過對影響因素的等高線圖、3D圖和多元線性回歸擬合，并對模型進(jìn)行方差分析，綜合得出每一個因素對野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率影響的顯著性水平，以及最佳值和最佳條件組合。

采用薄膜分散法結(jié)合超聲輔助法制備野菊花黃酮脂質(zhì)體，并用Design-Expert（7.1.6）軟件分析優(yōu)化制備條件，得到最佳條件為脂藥比9.5：1、膜材比8：1、超聲處理時(shí)間19 min，在此條件下制備的野菊花黃酮脂質(zhì)體包封率為77.82%，重現(xiàn)性較好。