牛曉靜，魯靜，曹英杰，段曉穎，徐立然

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

大孔吸附樹脂是一類不溶于酸和堿的有機(jī)高分子聚合物,具有較大的比表面積和特殊的吸附性能，在污水處理、環(huán)境污染等去除有毒有害物質(zhì)方面被廣泛運(yùn)用。近年來，大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物純化工藝中也被廣泛運(yùn)用，是提取分離天然植物中有效成分的一種高效手段[1-2]。

課題組徐立然教授根據(jù)多年治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的臨床經(jīng)驗，總結(jié)擬定了益元康方并在臨床長期應(yīng)用[3-6]。該方由靈芝、西洋參、淫羊藿組成，具有健脾益脾功能，用于治療AIDS免疫功能低下，癥見乏力、倦怠、神疲、肢冷、易感冒、腹瀉、舌苔淡白、脈弱，在臨床應(yīng)用多年療效顯著。為獲取淫羊藿中有效組分之一——總黃酮，本試驗通過比較淫羊藿總黃酮在11種不同型號大孔吸附樹脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹脂，應(yīng)用正交試驗和均勻試驗的方法對所選最佳樹脂純化淫羊藿總黃酮的動態(tài)吸附和解析工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為淫羊藿總黃酮的分離純化提供穩(wěn)定可行的工藝參數(shù)。

1 材料

TU-1800PC型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；CP225D型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))；BSA224S-CW型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))。

淫羊藿藥材(批號：140301，產(chǎn)地：甘肅隴南)，經(jīng)我院陳天朝主任藥師鑒定均符合《中國藥典》2015年版一部相關(guān)項下規(guī)定；淫羊藿苷對照品(批號：110737-200415，中國藥品生物制品檢定院提供)；甲醇、乙醇等試劑均為分析純；大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9(河北滄州寶恩化工有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樹脂預(yù)處理

稱取各樹脂用95%乙醇浸泡過夜，以乙醇濕法裝柱，用80%乙醇洗脫，控制流速為1.5 mL/min，收集乙醇洗脫液至加等量的純化水不顯渾濁為止，再繼續(xù)收集乙醇洗脫液，以95%乙醇為空白對照，采用分光光度法，在波長200～760 nm范圍內(nèi)掃描，直至洗脫液在紫外-可見光區(qū)無吸收即可，然后用大量的純化水洗至無醇味。

2.2 上樣液的制備

取淫羊藿100 g，置圓底燒瓶中，加15倍量60%乙醇，提取2次，每次165 min，合并濾液，減壓濃縮回收，得其濃縮液。精密稱取上述濃縮液適量置燒杯中, 加適量的蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾，測定含量，備用。

2.3 樹脂型號篩選

采用單因素試驗，通過對靜態(tài)吸附與解吸試驗，優(yōu)選樹脂型號：大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9，共計11種。

2.3.1 不同樹脂對淫羊藿總黃酮的吸附-解吸附性能

精密稱取已處理好的樹脂抽濾至干，分別稱取5.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加樣品液20 mL(0.5 g生藥量/mL)，每隔5 min振搖10 s，振蕩吸附，持續(xù) 2 h，然后靜置24 h，使其達(dá)到飽和吸附，取樣，依法測定吸附后溶液的淫羊藿總黃酮的含量[7]。按下式計算吸附容量。

吸附率(%)=(上柱前總黃酮質(zhì)量-吸附平衡后剩余總黃酮質(zhì)量)/上柱前總黃酮質(zhì)量×100%

上述吸附飽和的樹脂用適量的水沖去樹脂表面的溶液和雜質(zhì)，濾干，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 60%乙醇解吸附，于振蕩器上室溫振蕩24 h 使充分解吸附之后，移取上清液，依法測定吸光度并計算解吸附后溶液的淫羊藿總黃酮的含量。按下式計算解吸率。

解吸率(%)=解吸總黃酮質(zhì)量/吸附總黃酮質(zhì)量×100%

結(jié)果見圖1，綜合吸附率和解吸率可知D-101、AB-8、HPD-600、HPD-300、HPD-400 5種樹脂吸附和解吸附效果較好。因此，進(jìn)一步對上述5種樹脂進(jìn)行動態(tài)解吸附動力學(xué)考察，優(yōu)選出最佳樹脂。

2.3.2 不同樹脂對淫羊藿總黃酮的解吸附動力學(xué)

將靜態(tài)吸附飽和的樹脂過濾抽干,并用適量蒸餾水淋洗至流出液無色，加25 mL 60%的乙醇解吸附，分別在15、45、60、90、120、180、240、300、360 min取樣1次，取樣后用相應(yīng)溶劑補(bǔ)充相等體積，測定各樹脂解吸液中淫羊藿總黃酮的含量。并計算解吸率，繪制解吸動力學(xué)曲線。見圖2，HPD-400解吸速率快，解吸率在120 min內(nèi)基本達(dá)到平衡。

圖1 11種不同型號大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸

圖2 5種不同大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮的解吸動力學(xué)曲線

2.4 動態(tài)吸附正交試驗

上樣液的制備：取淫羊藿提取濃縮液適量，加水稀釋成不同濃度，根據(jù)動態(tài)吸附比吸附量設(shè)定上樣量(約為6 000 mg)，即1、2、3號試驗上樣體積為300 mL，4、5、6號試驗上樣體積為200 mL，7、8、9號試驗上樣體積為150 mL，分別收集流出液，測定流出液中總黃酮的含量，計算吸附率%。

因素：上樣液濃度(A)、徑高比(B)、上樣液pH值(C)，采用三因素9水平試驗，上樣流速根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定為1.0 mL/min。L9(34)實驗設(shè)計及安排見表1、2，通過測定總黃酮的含量，計算吸附率，優(yōu)選最佳吸附工藝。

表1 正交設(shè)計因素水平表

表2 正交試驗安排表及實驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00。

通過對表3進(jìn)行直觀分析，三個因素均有顯著性差異，最佳工藝為：A2B2C1，即：上樣液濃度30 mg/mL，上樣液pH值為4，徑高比1:8。按照上述優(yōu)選出的工藝參數(shù)平行3份進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果吸附率分別為99.36%、99.41%、99.39%，RSD值為0.03%，表明該吸附工藝穩(wěn)定性良好。

2.5 泄露曲線

取已處理好的HPD-400大孔吸附樹脂濕法裝柱，使徑高比為1∶8，取濃度為30 mg/mL，pH值為4的上樣液上樣，控制上樣流速為 1.0 mL/min，分段收集洗脫柱液，每20 mL收集一份，共收集15份，測定接收液中總黃酮濃度，以上樣體積為橫坐標(biāo)，泄露率為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 HPD-400大孔吸附樹脂上樣吸附泄露曲線

從第7份接收液開始已經(jīng)有總黃酮泄露，但此時泄露率僅為0.58%，相對于上樣量仍然很小，至第10份接收液泄露液濃度急劇增大，因此選擇泄露液濃度急劇增大前上樣，即4 BV。

2.6 均勻設(shè)計優(yōu)化總黃酮動態(tài)洗脫工藝

按上述確定的吸附條件，取上樣液分別通過HPD-400樹脂柱進(jìn)行吸附，吸附完成后先用3 BV水洗脫除去未吸附的總黃酮及其他雜質(zhì)，然后按照均勻設(shè)計安排表，以解吸率為考察指標(biāo)，分別考察洗脫液乙醇濃度(mg/mL)、洗脫液用量(BV)、洗脫流速(mL/min)三個因素對總黃酮純化的影響，具體見表4和表5。

表4 淫羊藿總黃酮動態(tài)洗脫均勻設(shè)計因素水平表

表5 淫羊藿總黃酮動態(tài)洗脫均勻設(shè)計安排表及實驗結(jié)果

利用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行回歸分析，選出最優(yōu)方程：Y=14.667+0.003X1X1+0.325X1X2-2.213X2X3，顯著水平P=0.003<0.05，相關(guān)系數(shù)R=0.962，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)R=0.925，表明方程擬合度良好，回歸方程有意義，在置信水平1-0.05=0.95下是可信的。對該方程規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：洗脫液乙醇濃度62%，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液用量4 BV。

2.7 總黃酮最佳純化工藝驗證

按照上述篩選的工藝進(jìn)行上樣吸附和解吸，收集流出液，測定總黃酮含量。結(jié)果顯示：3批總黃酮含量分別為：70.80%、71.95%、72.78%，RSD為1.38%，平均含量為71.84%，達(dá)到50%以上。表明該總黃酮純化工藝質(zhì)量穩(wěn)定、可行。

3 討論

由于淫羊藿提取物主要含黃酮類成分，根據(jù)黃酮類化合物的理化性質(zhì)可知，其提取物易溶于甲醇、稀乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，在熱水中溶解；筆者在制備上樣液試驗中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿提取物的水溶性并不是很好，因此造成上柱液配制濃度不容易控制，而且配制后的溶液容易析出沉淀，在上柱時容易堵塞。黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故需要通過調(diào)節(jié)溶液的酸堿性使其溶解。

根據(jù)樹脂的吸附性能和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)，本試驗選用了11種大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9篩選最佳樹脂。通過吸附-解吸附性能、解吸附靜態(tài)動力學(xué)研究，結(jié)果HPD-400為最佳。而對大孔吸附樹脂與靶標(biāo)分子的構(gòu)效關(guān)系及其分離規(guī)律的基礎(chǔ)研究有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于大孔吸附樹脂純化工藝參數(shù)研究[8-13]，大都采用單因素實驗逐個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，造成實驗時間過長、步驟繁瑣、只考慮單因素對實驗結(jié)果的影響。本文通過正交實驗、均勻設(shè)計對淫羊藿總黃酮動態(tài)吸附參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可以用較少的試驗次數(shù)揭示各試驗因素對指標(biāo)的影響的大小和規(guī)律，得到更多的信息，顯示出更大的優(yōu)越性，節(jié)約大量的時間和經(jīng)費(fèi)，也便于實施。確定的最佳純化工藝參數(shù)為：上樣液濃度30 mg/mL，上樣液pH值為4，徑高比1：8，上樣流速1.0 mL/min，最大上樣量4 BV；解吸先用3 BV水除雜，洗脫液乙醇濃度62%，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液用量4 BV。純化后的總黃酮平均含量為71.84%，比純化前總黃酮含量高3倍，RSD為1.38%，工藝穩(wěn)定可靠。