席 奔 柳巧禛 呂丹桂 徐偉榮 王振平,2 代紅軍,?

(1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021;2寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒教育部工程中心,寧夏銀川 750021)

葡萄(Vitis vinifera L.)為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物,是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)類果樹之一。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)統(tǒng)計(jì),2016年全球葡萄栽培面積達(dá)7.1×106hm2,其中我國栽培面積達(dá)8.4×105hm2, 占全球栽培面積的 11.8%。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是植物次級代謝產(chǎn)生的一種芪類化合物, 存在于 100 多種植物中, 在葡萄、虎杖(Polygonum cuspidatum Sibe.et Zucc)等植物中含量較高[1]。Res 及其衍生物具有抗血栓、抗氧化、抑制腫瘤等多種有益于人體健康的活性功能[2-3],還具有抵抗植物病原菌的作用[4-5]。Res 由苯丙烷類代謝途徑合成,參與合成的酶有苯丙氨酸裂解酶(phenylalanin ammonialyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸-CoA 連接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL) 和芪合成酶(stilbene synthase,STS),其中STS 是Res 合成的關(guān)鍵酶(圖1)。葡萄STSs 基因家族由48 個基因組成,至少有32 個基因有潛在的生物學(xué)功能[6]。H?ll 等[7]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MYB14 和MYB15 調(diào)節(jié)葡萄STS 基因的表達(dá),表明Res合成受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的控制。Wang 等[8]研究表明,葡萄Res 的合成與積累不僅與葡萄基因型有關(guān),還受外界環(huán)境的影響。

水分是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一[9]。大量研究表明水分脅迫會導(dǎo)致植物形態(tài)和生理生化發(fā)生變化,如阻礙植物地上部分生長、降低植物蒸騰及光合作用、導(dǎo)致滲透化合物和離子的積累等[10-12]。Kennedy等[13]研究表明,水分會影響葡萄果實(shí)類黃酮物質(zhì)的積累,進(jìn)一步影響葡萄與葡萄酒品質(zhì)。Castellarin 等[14]發(fā)現(xiàn)水分脅迫能誘導(dǎo)葡萄果實(shí)花青素和酚類物質(zhì)的積累。但目前關(guān)于水分脅迫如何影響葡萄Res 合成與積累的研究尚鮮見報道。

本研究以釀酒葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L. cv.Cabernet Sauvignon)為試驗(yàn)材料,對其進(jìn)行水分脅迫處理,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法和實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)分別檢測葡萄果實(shí)Res 含量和Res 合成相關(guān)基因的表達(dá)量,分析Res 合成過程中Res 與相關(guān)基因表達(dá)量的關(guān)系,探究水分脅迫對葡萄果實(shí)Res 合成的影響,以期為進(jìn)一步深入研究葡萄Res 合成調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 白藜蘆醇生物合成途徑[15]Fig.1 Resveratrol biosynthesis pathway[15]

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為15年生赤霞珠,試驗(yàn)在寧夏永寧縣(38.28°N,106.24°E)玉泉營葡萄園進(jìn)行,該地區(qū)屬中溫帶干旱氣候,土壤類型為淡灰鈣土,土質(zhì)為沙壤土。采用籬架栽培模式,“廠”字形整形,主干上每10 ～15 cm 留1 個結(jié)果枝,結(jié)果枝上留1 個穗果,產(chǎn)量約400 kg·667m-2,南北行向,株行距為0.5 m×3 m,冬季埋土防寒,灌溉方式為滴灌,滴灌流速為0.6 L·h-1。

于葡萄園中部選取長勢均一、無病蟲害的植株11行,每處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)30 株,不同處理之間間隔1 行(圖2)。結(jié)合葡萄園田間灌溉情況,并參考文獻(xiàn)[16]計(jì)算不同處理植株黎明前葉片水勢(φpredawn)。試驗(yàn)共設(shè)3 個處理：1)對照(CK)植株黎明前葉片水勢在-0.20 Mpa ≥φpredawn≥-0.40 Mpa;2)處理組1(T1)植株黎明前葉片水勢在-0.40 Mpa ≥φpredawn≥-0.60 Mpa;3)處理組2(T2)植株黎明前葉片水勢在φpredawn≤-0.60 Mpa。2017年5月25日為葡萄盛花期(full bloom,E-L23)[17],6月20日綠果期(berry pea size,E-L27)即花后25 d 開始進(jìn)行試驗(yàn)處理,并測得植株黎明前葉片水勢為-0.30 Mpa,之后每5 d 監(jiān)測1 次φpredawn,根據(jù)測定的φpredawn及試驗(yàn)期間葡萄園日降雨量和日氣溫(圖3),確定各處理是否灌水及所需灌水量(表1)。

圖2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖Fig.2 Schematic diagram of test design

花后30 d(30 days after anthesis,30 DAA)開始采集果實(shí),每10 d 采樣1 次,采樣在測定植株黎明前葉片水勢后進(jìn)行,在植株東西兩側(cè),隨機(jī)剪取果粒,一部分用于測定可溶性固形物(total soluble solid,TSS)和可滴定酸(titratable acid,TA)含量,另一部分液氮速凍后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黎明前葉片水勢測定 黎明前(5：30-6：00)迅速摘取葡萄枝條中部節(jié)位的葉片,用潮濕的紗布包好,裝入塑封袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室,用刀片在葉柄末端切出斜面,切割后迅速裝入3005 型植物水分壓力室(美國Soil Moisture Equipment 公司)中,使葉柄末端切口從壓力室密封圈中部的小孔露出,固定好,擰緊鋼塞,關(guān)閉控制閥,此時緩慢轉(zhuǎn)動加壓閥,同時用放大鏡仔細(xì)觀察葉柄末端,當(dāng)葉柄末端出現(xiàn)小水滴的一剎那,立即關(guān)閉加壓閥,此時讀數(shù)表盤指針?biāo)谖恢玫臄?shù)值,即為葉片水勢的絕對值,記錄數(shù)值。每個處理選取3棵植株,每棵植株取3 片葉子。

圖3 試驗(yàn)期間氣溫(A)和日降雨量(B)Fig.3 Air temperature (A) and daily rainfall (B)

1.2.2 百粒重測定 隨機(jī)取300 顆果實(shí),利用電子天平(0.000 1 g)稱重,重復(fù)3 次,取平均值。

1.2.3 可溶性固形物含量測定 在室溫下,隨機(jī)取果實(shí)100 顆于塑封袋中,手工擠汁,然后取適量果汁用WYT-32 手持糖量折光儀(福建省泉州光學(xué)儀器廠),重復(fù)3 次,取平均值。

1.2.4 可滴定酸含量測定 將1.2.3 中剩余的果汁轉(zhuǎn)移至離心管中,5 000 r·min-1離心10 min,取10 mL上清液于100 mL 容量瓶中,蒸餾水定容。取20 mL 定容后的液體于三角瓶中,用0.05 mol·L-1NaOH 溶液滴定。果實(shí)中可滴定酸含量以酒石酸計(jì)。

1.2.5 白藜蘆醇測定 參照李曉東等[18]的方法。取1 g 葡萄樣品,液氮研磨至粉末狀后,用10 mL 乙酸乙酯浸提,超聲提取(80 Hz,30℃)12 min,然后4℃避光浸提1 h,10 000 r·min-1離心10 min。取上清液,殘?jiān)屑尤? mL 乙酸乙酯重新離心取上清液,合并上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,40℃旋轉(zhuǎn)蒸干,干燥物用2 mL 甲醇(色譜純)溶解,置于2 mL 離心管,-20℃避光貯存。高效液相色譜條件：AGILENT1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);C18 柱子(250 mm×4.6 mm,5 μm);二極管陣列(DAD);檢測波長306 nm;流動相乙腈∶水(40 ∶60,v/v),流速0.8 mL·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 總RNA 的提取和實(shí)時熒光定量PCR 總RNA 提取按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒DP441 說明書進(jìn)行。以總RNA 為模板,利用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與純化。選取EF1、Actin 為內(nèi)參基因,PAL、4CL、CHS、STS、Myb14、Myb15 基因引物用Primer 5.0 設(shè)計(jì),引物由蘭州生工合成部合成(表2)。RT-qPCR 反應(yīng)體系為25 μL：cDNA(100 ng·μL-1)1 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL,2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。RT-qPCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min;94℃變性10 s,54～56℃退火30 s,40 個循環(huán);72℃延伸32 s。每個模板設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),取平均值。目的基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[19]計(jì)算。

表2 RT-qPCR 引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 8.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析,Excle 2010 和SigmaPlot 12.0 進(jìn)行繪圖,通過SNK 法進(jìn)行ANOVO 分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對葡萄果實(shí)百粒重、可溶性固形物及可滴定酸的影響

由圖4 可知,25 ～70 DAA,CK φpredawn在-0.19 ～-0.48 MPa 范圍內(nèi);60～65 DAA 的降雨導(dǎo)致φpredawn上升,同樣,85 ～90 DAA 也出現(xiàn)相似的情況。雖然降雨引起了φpredawn上升,但在采樣時各處理φpredawn均在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)。70 ～75 DAA 雖有降雨但降雨量較小且降雨恰巧在測定φpredawn之后,所以φpredawn呈下降趨勢。

各處理均在2017年4月24日葡萄萌芽,5月25日盛花(50%的花帽脫落),6月8日坐果,6月13日(20 DAA)出現(xiàn)幼果,轉(zhuǎn)色(E-L35)時間各處理存在差異,其中CK 為7月30日(65 DAA)-8月4日(70 DAA)、T1 為7月23日(58 DAA)-7月29日(64 DAA)、T2 為7月25日(60 DAA) -8月1日(67 DAA),各處理均在9月13日(110 DAA)收獲。

圖4 不同處理黎明前葉片水勢Fig.4 Leaf water potential predawn for different treatments

由圖5-A 可知,隨著生育進(jìn)程的推進(jìn),各處理百粒重呈先增加后趨于平穩(wěn)的變化趨勢,其中CK 不同花后天數(shù)百粒重均顯著大于T1、T2(60 DAA 除外),110 DAA 時達(dá)到最大,為115.97 g,T1、T2 分別為109.34 g、82.53 g。由圖5-B 可知,隨著生育進(jìn)程的推進(jìn),各處理TSS 含量逐漸增加,其中60 ～70 DAA增速最快。不同處理之間TSS 含量存在明顯差異,轉(zhuǎn)色前T2 的TSS 含量均顯著高于CK 和T1,T1 與CK 差異均不顯著;轉(zhuǎn)色后T1 的TSS 含量明顯增加且高于T2,但總體上低于CK,表明短期的水分脅迫能夠提高果實(shí)TSS 含量,但長期的脅迫會降低TSS含量。由圖5-C 可知, 隨著生育進(jìn)程的推進(jìn),各處理TA 含量呈逐漸降低的趨勢,其中轉(zhuǎn)色期TA 含量下降明顯,不同處理間TA 含量差異明顯。T2 的TA含量除了在40 DAA 和100 DAA 時高于CK,其余時期均低于CK,成熟期(110 DAA)CK、T1、T2 的TA 平均含量分別為7.36、6.19 和7.28 g·L-1FW,且T1的TA 含量明顯低于CK 和T2,表明水分脅迫會降低TA 含量。

2.2 水分脅迫對葡萄果實(shí)白藜蘆醇含量的影響

圖6-A 為Res 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖,其保留時間為4. 705 min;圖6-B 為樣品色譜圖,表明試驗(yàn)?zāi)茌^好地提取及檢測到Res。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程：y=108. 2 x-1. 73,y 表示306 nm 波長處的面積,x 表示Res 的濃度,相關(guān)系數(shù)R2=0. 999 7,表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,能對樣品中的白藜蘆醇進(jìn)行定量分析。

白藜蘆醇含量在果實(shí)轉(zhuǎn)色前含量較低在轉(zhuǎn)色后快速增加,即隨著果實(shí)逐漸成熟而增加。不同處理對白藜蘆醇含量影響存在差異,T1 和T2 均能增加白藜蘆醇含量,其中T1 效果最佳。60 ～100 DAA 期間,T1 均極顯著高于CK 和T2,且在90 DAA 時達(dá)到最大,為20.41 μg·g-1FW,是CK 的7.70 倍(表3)。

2.3 水分脅迫對白藜蘆醇合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖7 可知,隨著果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期,白藜蘆醇合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá),果實(shí)完全著色后,又開始下調(diào)表達(dá)。70 DAA 時,T1 和T2 的PAL、4CL、STS、MYB14和MYB15 表達(dá)量均高于CK;80 DAA 時,T1 的PAL、4CL、MYB15 表達(dá)量高于CK,而STS、MYB14 低于CK;90 DAA 與70 DAA 相似,其中T1 PAL、STS 表達(dá)量達(dá)到最大,且與CK 差異極顯著,分別是CK 的2.4倍和2.6 倍,而T2 明顯低于CK;100 DAA 和110 DAA 時,T1 的PAL 和4CL 表達(dá)量也高于CK,且與CK 差異顯著,MYB14 和MYB15 表達(dá)量均為T1 高于CK,T2 低于CK,T1 STS 表達(dá)量則低于CK。CHS 雖然不直接參與白藜蘆醇合成,但與STS 有共同的作用底物(4-香豆酰CoA),除60 DAA,其他時期T1 和T2 的CHS 表達(dá)量均極顯著低于CK,表明水分脅迫導(dǎo)致CHS 下調(diào)表達(dá)。

圖5 不同處理葡萄果實(shí)百粒重、可溶性固形物及可滴定酸含量Fig.5 Total soluble solids content and 100 grains weight and titratable acid content of grape barries with different treatments

2.4 白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

葡萄果實(shí)白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明,在果實(shí)成熟過程中,白藜蘆醇合成與相關(guān)基因的表達(dá)量具有一定的相關(guān)性,CK 的STS 基因表達(dá)量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.823(P = 0.044 2 ＜0.05)。T2 的PAL、STS 基因表達(dá)量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.788(P=0.042 4＜0.05)、0.852(P=0.031 2＜0.05)(表4)。表明水分脅迫提高了相關(guān)基因的表達(dá)量。

表3 水分脅迫對葡萄果實(shí)白藜蘆醇含量的影響Table 3 Effect of water stress on resveratrol content of grape berries/(μg·g-1FW)

圖6 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(A)及試驗(yàn)樣品(B)色譜圖Fig.6 The chromatograms of standards of resveratrol(A)and test sample(B)

表4 不同處理下白藜蘆醇含量與白藜蘆醇合成相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of transcription level of resveratrol biosynthesis related genes and resveratrol content

3 討論

白藜蘆醇是植物產(chǎn)生的一種抗毒素,受病原體感染[20]、紫外線輻射[21]、機(jī)械損傷[22]等生物或非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生。Vezzulli 等[23]研究表明,巴貝拉葡萄(V.vinifera cv. Barbera)果實(shí)在水分脅迫下芪類化合物積累量未增加。這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致,可能是因?yàn)椴煌贩N葡萄中白藜蘆醇的分布和對生物或非生物脅迫響應(yīng)存在差異[24]。Castellarin 等[14]研究表明,水分脅迫會導(dǎo)致PAL 基因表達(dá)量增加并誘導(dǎo)類黃酮物質(zhì)的積累。本研究也發(fā)現(xiàn),水分脅迫使PAL 基因表達(dá)量顯著增加且PAL 基因表達(dá)量與白藜蘆醇含量呈顯著正相關(guān),表明水分脅迫可通過誘導(dǎo)PAL 基因進(jìn)一步增加白藜蘆醇積累量。STS 是白藜蘆醇合成的關(guān)鍵酶。H?ll 等[7]證明了MYB14 和MYB15 能夠調(diào)控葡萄STS基因表達(dá)。本試驗(yàn)中水分脅迫導(dǎo)致葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色前期和成熟期STS 基因表達(dá)量增加,且T2 的MYB14、MYB15 與STS 基因表達(dá)量的變化趨勢相似,但相關(guān)性分析表明MYB15 表達(dá)量與白藜蘆醇含量呈負(fù)相關(guān),推測MYB14 可能響應(yīng)水分脅迫參與調(diào)控STS 基因表達(dá)。王琴飛[25]研究認(rèn)為,CHS 雖然不直接參與白藜蘆醇合成,但與STS 有共同的作用底物。在自然條件下苯丙氨酸代謝途徑通過CHS 酶合成花色素和其他酚類物質(zhì),而當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時,會激活STS 基因進(jìn)入二苯乙烯途徑合成白藜蘆醇。本試驗(yàn)中水分脅迫使葡萄果實(shí)CHS 基因表達(dá)量顯著下降,而STS 基因表達(dá)量顯著增加,進(jìn)一步誘導(dǎo)白藜蘆醇含量增加提高了植株的抗逆性。

圖7 水分脅迫對葡萄果實(shí)白藜蘆醇合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of water stress on transcription level of resveratrol biosynthesis related genes in grape berries

殷向靜[26]對山葡萄(Vitis amurensis Rupr)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇合成受激素、轉(zhuǎn)錄因子、STSs 基因及其上下游基因等的調(diào)控,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),STSs 基因上游調(diào)控區(qū)域含有多種順式作用元件,主要包括光響應(yīng)元件ACE、GT1-motifi 和G-box、環(huán)境特異性元件TC-rich repeats(參與干旱脅迫響應(yīng))、過程特異性元件ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、CGTCA-motif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)等。Chaves 等[27]研究表明,水分脅迫會導(dǎo)致植物芽減少、抑制葉的生長從而改變植物冠層結(jié)構(gòu),使植物暴露在太陽光下的機(jī)率增大。光和熱效應(yīng)會導(dǎo)致一些靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能發(fā)生變化,如水分脅迫下葡萄黃酮類化合物代謝途徑的基因。因此,推測水分脅迫可以通過STSs 基因上游的光響應(yīng)元件參與調(diào)控白藜蘆醇的合成[28-29]。但具體是哪種主要的光響應(yīng)元件參與水分脅迫誘導(dǎo)白藜蘆醇的合成還有待進(jìn)一步研究。此外,水分脅迫也會改變植物內(nèi)源激素含量,如增加脫落酸、水楊酸含量等[30-31]。研究表明外源水楊酸處理可以使PAL、STS 基因表達(dá)上調(diào),且能增加葡萄細(xì)胞白藜蘆醇含量[32]。脫落酸反應(yīng)元件結(jié)合因子VvABF2 過表達(dá)可以明顯增加葡萄轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系白藜蘆醇和反式白藜蘆醇苷(trans-piceid)的積累[33]。不同STSs 基因啟動子中含有的順式作用元件的種類和分布不同,對不同激素的響應(yīng)也有差異,最終導(dǎo)致STSs 基因產(chǎn)生差異的表達(dá)模式[26]。但STSs 基因中具體哪些成員在水分脅迫誘導(dǎo)白藜蘆醇合成中起主導(dǎo)作用尚不清楚。因此,水分脅迫誘導(dǎo)白藜蘆醇積累的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,短期的水分脅迫能夠提高果實(shí)可溶性固形物含量;水分脅迫會降低果實(shí)可滴定酸含量,增加果實(shí)白藜蘆醇含量;水分脅迫對果實(shí)轉(zhuǎn)色前期和后期PAL、STS 基因表達(dá)的促進(jìn)作用最為顯著,但也會顯著降低CHS 基因的表達(dá),表明水分脅迫主要通過誘導(dǎo)PAL、STS 基因表達(dá)從而提高果實(shí)白藜蘆醇含量。綜合來看,黎明前葡萄葉片水勢在-0.40 Mpa ≥ψpredawn≥-0.60 Mpa 處理下花后100 d 采收釀酒葡萄較好,此時果實(shí)可溶性固形物含量為18.50%,可滴定酸含量為7.31 g·L-1FW,白藜蘆醇含量為16.28 μg·g-1FW。本研究為提高富含白藜蘆醇的釀酒葡萄原料以及進(jìn)一步探究葡萄白藜蘆醇合成調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。