李飛

【摘 要】盡管臨床微生物實驗室因新技術(shù)的不斷出現(xiàn)而發(fā)生巨大變化，但作為傳統(tǒng)技術(shù)的革蘭染色仍然具有相當(dāng)重要的作用。它可先于培養(yǎng)結(jié)果，迅速地為臨床醫(yī)生提供潛在病原菌信息，進而為經(jīng)驗性治療方案指出方向。本文將重點介紹革蘭染色涂片檢查的工作原理和方法，并簡單論述影響革蘭染色結(jié)果的相關(guān)因素，以提高廣大群眾的認知，積極配合臨床檢驗工作，也有助于提高實驗結(jié)果的準確性。

【關(guān)鍵詞】革蘭染色;涂片檢查;操作步驟;影響因素

【中圖分類號】R446.5【文獻標識碼】B【文章編號】1672-3783（2019）08-03--01

1 案例介紹

某患者，男，34歲，因排尿刺痛和排尿困難2天，到我院泌尿外科就診。檢查見：尿道口紅腫并伴有黏稠膿性分泌物，取膿性分泌物涂片后送檢驗科微生物室檢查。革蘭染色后，鏡下見大量白細胞及革蘭陰性雙球菌，可見細胞內(nèi)吞噬形態(tài)，報告為“涂片查見革蘭陰性雙球菌（細胞內(nèi)）”，同時尿常規(guī)結(jié)果顯示白細胞（WBC）陽性，尿沉渣結(jié)果顯示W(wǎng)BC 78.6 /μL（正常參考值0～26）。臨床考慮為急性淋菌性尿道炎，進行對癥治療，輸液消炎。

用藥治療5d后癥狀顯著緩解，又到本市另一家三甲醫(yī)院進行尿道分泌物革蘭染色涂片檢查，結(jié)果為 “涂片未查見革蘭陰性雙球菌”?；颊邔Υ吮硎静焕斫?，用藥治療后癥狀雖有緩解，但其仍存有一定的不適癥狀，為何革蘭染色涂片檢查未見有革蘭陰性雙球菌。檢驗人員耐心解釋，淋病奈瑟菌感染后起始癥狀為急性尿道炎，經(jīng)有效藥物治療后可使病原菌減少或消失，從而病情得到控制。但機體處于恢復(fù)期，病原體即使殺滅后也會因為代謝產(chǎn)物反應(yīng)而出現(xiàn)某些不適癥狀，需繼續(xù)進行鞏固治療。革蘭染色涂片檢查顯示陰性表示病情已有好轉(zhuǎn)，治療有效。

究竟什么是革蘭染色涂片檢查呢？下文將逐一論述。

2 革蘭染色涂片檢查概述

2.1 革蘭染色的工作原理

革蘭染色法是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立，直到現(xiàn)今，其仍是細菌學(xué)檢驗中廣泛應(yīng)用的一種鑒別染色法。該方法主要用于細菌分類與鑒定，通過初染、媒染、脫色復(fù)染步驟使細菌與背景形成較為鮮明的對比，這就有助于清楚地觀察到細菌的結(jié)構(gòu)、排列方式、形態(tài)特征等，還可以根據(jù)菌體著色情況的不同將細菌分為革蘭陽性菌（菌體呈紫色）和革蘭陰性菌（菌體呈紅色）兩種，故其在初步識別細菌，縮小診斷范圍方面具有不可替代的作用[1]。其次，該方法也可為藥物選擇提供參考依據(jù)，這是因為革蘭陰性菌、革蘭陽性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)差異較大，其治療所用的抗生素也不盡相同，故進行革蘭染色檢查有助于臨床治療用藥。

2.2 革蘭染色檢驗步驟

（1）涂片：用接種環(huán)蘸取少量無菌生理鹽水到潔凈的玻片上，隨后用接種環(huán)取少量經(jīng)細菌培養(yǎng)的菌落與生理鹽水混勻制作成涂片。

（2）干燥：在室溫下將涂片進行干燥處理。

（3）固定：標本面朝上，手持玻片的一側(cè)在酒精燈的火焰外側(cè)來回移動3～4次，玻片的溫度以手背皮膚觸及玻片背面不燙手為宜，隨后在室溫中放置冷卻。

（4）染色（快速革蘭染色法Baso試劑）：①初染：將檢測的涂片固定后，在涂片的菌膜上滴加適量的龍膽紫染液，染色10s，水洗，甩干;②媒染：在涂片菌膜表面滴加適量的碘液，染色10s，水洗，甩干;③脫色：滴加數(shù)滴脫色液，輕輕搖動涂片以進行脫色，10s后水洗，甩干;④復(fù)染：加沙黃染色液復(fù)染10s，水洗;⑤在空氣中晾干進行鏡檢。

3 影響革蘭染色結(jié)果的相關(guān)因素

3.1 細菌因素

抗菌藥物影響：細菌培養(yǎng)所用標本應(yīng)在使用抗菌藥物之前采集，若細菌已受抗菌藥物作用，則其形態(tài)大小排列及染色性均可發(fā)生改變。

（2）菌齡因素：細菌在生長繁殖過程中，只有在生長旺盛且各種生物特征均穩(wěn)定階段的細菌能夠真實反映細菌的生化反應(yīng)及染色性情況。若細菌培養(yǎng)時間過長，菌齡過大，則細胞衰老，各種生命特征趨于衰敗，勢必影響涂片染色結(jié)果各項相關(guān)檢查準確性[2]。

3.2 涂片質(zhì)量因素

（1）涂片厚度：當(dāng)涂片太厚時細菌無法分開，在脫色時由于涂片太厚導(dǎo)致第一步染上的龍膽紫顏色無法完全脫去，這就會使染色結(jié)果出現(xiàn)著色不均的情況，革蘭陰性菌可能出現(xiàn)紫色，從而影響結(jié)果判斷。

（2）干燥固定：涂片的固定不僅殺死細菌，改變其細胞壁的滲透性，還可讓細菌黏附在載玻片上，使其維持原有的形態(tài)。準確的涂片固定方法是把干燥的涂有細菌的載玻片以合適的溫度進行烘烤。若在干燥或固定過程中載玻片干燥溫度過高或火烤時

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間過長，則會影響細菌的滲透性，導(dǎo)致菌體染色結(jié)果出現(xiàn)異常。

（3）脫色時間掌握不當(dāng)：一般情況下，陰性菌的滲透性較大，易脫色;而陽性菌的滲透性較低，不易被脫色。然而，在兩種菌體固定時間相同的條件下，若脫色時間過短會出現(xiàn)革蘭陰性菌染上龍膽紫溶液后未能完全脫色，而誤判為陽性菌;若脫色時間過長，會讓一些革蘭陽性菌脫色過度，呈現(xiàn)陰性菌的著色特征，影響結(jié)果判定。因此，在實際脫色操作中需根據(jù)涂片的厚度靈活掌握脫色時間，快速革蘭染色一般為10s，可根據(jù)室溫及涂片厚度情況靈活掌握。

3.3 染液因素

（1）初染的龍膽紫溶液使用不對：若使用的龍膽紫溶液濃度過高，會使其不容易脫色，這就有可能使陰性菌被誤認為是陽性菌。

（2）媒染的碘液放置時間過長：選擇碘液作為媒染劑是因為其能夠提高染液與細菌的親和力。但在染色過程中使用了放置時間較長的碘液進行媒染，會影響其媒染作用，導(dǎo)致染劑與細菌的結(jié)合不牢固，易脫色，造成陽性菌誤認為陰性菌。

（3）脫色使用的脫色液濃度不當(dāng)：脫色液濃度不同則脫色效果不同，以常用的Baso快速革蘭染液來說，厚薄適宜的涂片滴加脫色液后輕輕搖動玻片至無紫色脫出即可，時間大約幾秒到10s.若脫色液濃度偏低則應(yīng)適當(dāng)延長脫色時間。

3.4 溫度對染色的影響

一般來說，室溫升高則革蘭氏染色各步操作均可適當(dāng)縮短時間，而室溫低于正常時則應(yīng)適當(dāng)延長各步時間，若缺乏經(jīng)驗，可增加質(zhì)控片作為染色參考來控制染色效果。

4 總結(jié)

革蘭氏染色是微生物檢測過程中常用到的基本技能之一，也是輔助臨床鑒別細菌種類的基礎(chǔ)方法之一。由于細菌的結(jié)構(gòu)存有差異，故通過染色可形成不同的染色效果，因此充分了解染色性能以及染色結(jié)果的影響因素，提高檢測準確性，有助于細菌的鑒別診斷以及臨床用藥。

參考文獻

寧丹.淺析微生物標本培養(yǎng)前涂片革蘭染色鏡檢的臨床研究意義[J].臨床檢驗雜志，2018，7（1）58-60.

王芳，宋瑛琳，田明.革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析[J].實驗室科學(xué)，2009，6（1）：104-106.