魏 玲 程小艷 李寶明 汪 雨 高麗娟 王成彬 倫永志

(北京市理化分析測試中心，北京100089)

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用,它們通過對蛋白酶原的激活或抑制而起調節(jié)因子作用。在腫瘤細胞中，絲氨酸蛋白酶通過對基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)進行剪切進而誘導其活化，活化的MMPs水解細胞外基質。故絲氨酸蛋白酶通過參與胞外基質水解過程，進而一定程度上控制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。而絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpins(Serine protease inhibitors)可通過對絲氨酸蛋白酶活性的抑制間接抑制MMPs活性來影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)是一類分子質量在40～50 kD 的蛋白酶抑制劑。動物、植物、古細菌、細菌、病毒的基因組中都有Serpins基因家族存在，Serpins是參與免疫調節(jié)和其他生物學通路的重要因子。迄今為止，已發(fā)現1 500余個Serpins家族成員，分為抑制型和非抑制型兩大類。人體內共含有36個功能性Serpins。Serpins功能多樣，參與血液凝固、炎癥反應、細胞遷移、纖維蛋白溶解、補體激活、胞外基質重建、激素運輸以及細胞凋亡等生理學過程的調控。引入外源有意義的Serpins可作為靶向藥物治療來實現機體平衡的恢復，例如：病毒源的Serpin-1已經作為一類新的免疫調節(jié)劑被開發(fā)出來[1]。在腫瘤研究領域，Serpins通過對MMPs的抑制作用影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，這一理論使其有望成為新型抗腫瘤藥物，但目前尚處于基礎研究階段，距離藥物開發(fā)還有很遠的路要走。本文對惡性腫瘤相關的7個Serpins進行綜述[2，3]。

1 Serpins的結構與作用機制

Serpins具有約350～400個氨基酸殘基，其空間結構高度保守：①C-末端具有3個β片層結構(命名為A、B、C)；②8～9個α螺旋結構；③以及一個N-末端的反應中心回環(huán)結構(Reactive center loop，RCL)。結構示意圖見圖1。Serpins是絲氨酸蛋白酶的內源性抑制劑，其作用于絲氨酸蛋白酶包含三個步驟：①絲氨酸蛋白酶(靶酶)特異性識別Serpins的RCL結構域，與其結合形成米氏復合物，②靶酶切開RCL序列的P1-P1′鍵，斷開的P1-P1′鍵與靶酶形成?；?酶中間體，③RCL的氨基末端部分作為額外的反向平行鏈(S4A)插入β-折疊A中，引起Serpins構象發(fā)生變化進而與蛋白酶形成穩(wěn)定的共價復合物使其失活。

腫瘤細胞的轉移(Migration)與侵襲(Invasion)是惡性腫瘤擴散的關鍵步驟，在這一過程中，一種絲氨酸蛋白酶：尿激酶型纖溶酶原激活因子(Urokinase-type plasminogen activator，uPA)能夠對基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)進行剪切進而誘導其活化?；罨腗MPs能夠水解細胞外基質(Extra-cellular matrix，ECM)實現腫瘤細胞的轉移與侵襲作用。uPA是腫瘤細胞轉移與侵襲的調控樞紐，發(fā)現和篩選其抑制劑在惡性腫瘤診療，特別是預防惡性腫瘤轉移與復發(fā)中具有重要意義。因此，Serpins是有希望的抗腫瘤治療藥物。

圖1 Serpins結構示意圖Fig.1 Serpins structure diagram

2 惡性腫瘤細胞轉移與侵襲相關Serpins

2.1纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1) 纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1，又稱 SERPINE 1)是組織型纖溶酶激活子(tissue type plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活子(urokinase-type plasminogen activator，uPA，以下簡稱uPA)的主要抑制劑[4]。目前被證明只有在神經膠質瘤細胞中能夠抑制癌細胞侵襲[5]。報道稱PAI-1能夠促進乳腺癌細胞MDA-MB-435的轉移與侵襲作用[6]。乳腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、肺癌五種癌細胞基質中PAI-1含量升高反而顯示預后不良[7-11]。鑒于以上矛盾結果，有學者認為，PAI-1和uPA之間的平衡才是問題的關鍵。例如在4T1乳腺癌細胞模型中，當調節(jié)uPA/PAI-1平衡偏向于uPA時，腫瘤的生長和轉移受到抑制[12]。雖然PAI-1在腫瘤細胞遷移中的作用機制已有研究[13-17]，但機制仍不明確，故仍需進一步長期深入研究。

另外，還有研究表明PAI-1可以作為腫瘤預后標志物識別患侵襲性腫瘤轉移的風險，作為一種生長因子和一些癌癥凋亡的抑制劑，它也可以成為癌癥的治療靶點，開發(fā)PAI-1的抑制劑作為治療試劑[18，19]。

2.2纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2) 纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2;又稱SERPINB2)屬于Serpins中卵清蛋白亞家族(Ovalbumin subfamily)。在功能和結構上與PAI-1有較大差異。與PAI-1類似，PAI-2也抑制uPA的活性，不過其效率比較慢。與PAI-1不同的是，PAI-2一般不與VN結合。PAI-2與PAI-1競爭性結合uPA，PAI-2對 uPA的活性抑制能力更強。因為PAI-2只抑制uPA，所以PAI-2可能是uPA“真正”的抑制蛋白。不管在細胞內還是在細胞表面，在PAI-1的存在下，PAI-2都能夠有效地抑制uPA。另外，PAI-2和PAI-1之間另一個值得關注的差異是PAI-2不與LRP結合，不激發(fā)次級有絲分裂信號(Secondary mitogenic signals)。但是，PAI-2與uPA結合形成的復合物可以與LRP結合并被細胞內化[20]。PAI-2具體的參與生理作用的機制目前還不明確。

PAI-2已經被明確證明能夠抑制癌細胞遷移從而抑制癌癥的發(fā)展。PAI-2高度表達與患者生存期的延長和乳腺癌細胞遷移的轉弱有關，PAI-2高表達預示良好的預后；而PAI-2低表達的患者預后很差[21]。細胞實驗顯示，PAI-2具有對惡性腫瘤細胞強烈的抑制作用。但PAI-2在細胞內和細胞外所起的確切作用還不十分明確，因此PAI-2發(fā)揮作用的分子機制尚需進一步研究。

2.3蛋白C抑制劑(Serpin protein C inhibitor，PCI) Serpin蛋白C抑制劑(Serpin protein C inhibitor，PCI；又稱PAI-3或SERPINA5)與PAI-1、PAI-2類似，也具有對uPA的抑制活性。PCI具有對多種惡性腫瘤細胞轉移與侵襲的強烈抑制作用，包括腎癌(Clear cell renal cell carcinoma)、前列腺癌(Prostate cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)和乳腺癌癌(Breast cancer)[22-26]。例如：在乳腺癌細胞系MDA-MD-231中，外源上調PCI能夠顯著降低癌細胞遷移和入侵的能力[25]，晚期卵巢癌中PCI表達的減少與侵襲有關[26]。

目前PCI作用的分子機制尚無公認模式，目前只有Fortenberry等[27]于2010年研究發(fā)現了PCI可以通過抑制溶酶體蛋白L(cathepsin L)來調控腫瘤的遷移，即cathepsin L 是PCI潛在靶蛋白。其研究認為癌細胞把cathepsin L分泌到細胞外，cathepsin L通過內吞降解胞內和胞外的蛋白質，降解胞外基質，實現對細胞間質與組織基底膜(ECM)的破壞，而PCI可以抑制cathepsin L活性功能進而抑制腫瘤細胞轉移。

2.4蛋白酶Nexin-1 蛋白酶Nexin-1又稱NP-1、SERPINE2，其結構與Serpine 1相似，其主要在神經系統(tǒng)和血管中表達，而血漿中的分布較少。但在炎癥反應的刺激下，其在血漿中的含量會上升。血漿中的Nexin-1通常比較少，但是在各種炎癥的刺激下，其含量會上升。Nexin-1參與凝血酶誘導的途徑，例如神經元增殖，神經突增生和腦損傷期間的細胞凋亡。Nexin-1不僅僅抑制凝血酶，同時也抑制纖溶酶原激活劑和纖溶酶。

Nexin-1具有抑制腫瘤血管生成的能力和抗血管生成的能力[28]，Selbonne等[28]認為Nexin-1能夠阻斷VEGF誘導內皮細胞增殖、遷移和血管形成。另一項研究結果表明，在C6神經膠質瘤細胞中下調Nexin-1的表達能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲作用，上調uPA、MMP-9、MMP-2的表達[29]。在乳腺癌、胰腺癌和鱗狀細胞癌三種癌細胞系的研究中發(fā)現，PN-1過表達，且過表達的PN-1與細胞侵襲性有關[30-32]。

2.5神經源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Neuroserpin) Neuroserpin (又稱SERPINI1)主要在中樞神經系統(tǒng)表達，Neuroserpin也能夠抑制tPA和uPA等的活性，Neuroserpin在神經元中可以防止纖溶酶原激活物的細胞毒性，被認為是中樞神經系統(tǒng)中tPA的主要抑制劑。與PAI-1作用機制一樣其通過抑制MMP通路來抑制細胞遷移。

然而，最近研究表明乳腺癌腦轉移和肺癌腦轉移的腦實質中的Neuroserpin能通過抑制纖溶酶介導的死亡信號通路促進癌細胞的轉移作用。具體作用機理為：血纖維蛋白溶酶切割膠質細胞來源的Fas 配體 (FAS L)蛋白，生成可溶的FAS L蛋白(sFAS L)，并且在腦實質細胞中擴散，誘導癌細胞的凋亡。另外，血纖維蛋白溶酶能夠激活L1CAM黏著分子的表達，從而防止癌細胞沿著腦毛細血管擴散，這可以有效抑制癌細胞在腦中的轉移。但是神經元過表達的Neuroserpin可以抑制纖溶酶原激活物活性，抑制上述機制發(fā)生，從而促進癌細胞轉移。故高度表達的Neuroserpin促進癌細胞腦部的轉移[33]。

2.6乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(Maspin) Maspin(又稱為SERPINB5)被認為是一類非抑制型的Serpins，是一種在上皮細胞中表達的Ⅱ型腫瘤抑制因子(Class Ⅱ suppressor)。Maspin能夠抑制細胞表面uPA的活性，增加細胞的黏著能力，抑制細胞從基底膜上脫離，抑制uPA以及腫瘤血管生成[34,35]。

在乳腺癌和前列腺癌細胞中，P53能夠誘導Maspin的表達，進而抑制腫瘤的生長和轉移；而敲低Maspin的表達能夠上調增強腫瘤細胞的遷移和侵襲作用[36]。2013年，Abraham等[37]的研究也證實了這一趨勢：乳腺癌與前列腺癌細胞中Maspin高表達的患者預后較好。但是Teoh 等[38]于2014年研究發(fā)現Maspin不能抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲和克隆形成。以前觀察到的結果實際上是PHLPP1基因所起的作用，Maspin并不是腫瘤抑制因子。Maspin在癌癥調控中的作用到底如何，需要更多深入的研究。

2.7色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF) 色素上皮衍生因子(Pigment epitheli-um-derived factor，PEDF)又稱SERPINF1，其與Maspin類似，是一種非抑制型的Serpin，具有抗腫瘤血管生成和抗腫瘤發(fā)生的功能。與Maspin不同的是PEDF不與uPA結合而與uPAR結合。

研究表明PEDF通過抑制腫瘤血管生成、腫瘤生長和細胞遷移來抑制癌癥。PEDF能夠抑制胰腺癌細胞、卵巢癌細胞的增殖、轉移與遷移作用。另外，體內實驗也表明，PEDF的過表達能夠抑制腫瘤生長和腹膜轉移[39]。PEDF作為神經類Serpins能夠促進乳腺癌來源細胞在腦中的轉移，最新研究顯示PEDF還可以作為細胞轉移的抑制因子發(fā)揮功能。如腦轉移瘤中PEDF的表達量下降，異源移植模型和同系小鼠模型實驗中PEDF能抑制乳腺癌細胞向腦轉移，保護腦神經細胞免受癌細胞的損害[40]。

表1 參與調控腫瘤細胞遷移及腫瘤惡化的Serpins情況列表

Tab.1 List of Serpins that have been shown to regulate tumor cell migration and cancer progression

Serpin名稱通用名底物在腫瘤細胞遷移中的作用癌癥類型Serpin E1PAI-1uPA、tPA、plasminPAI-1在腫瘤細胞遷移、侵襲和血管生成中具有刺激作用和抑制作用。PAI-1的過表達與不良預后有關。乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、腎癌Serpin B2PAI-2uPAPAI-2表達增加與良好的預后相關,PAI-2表達的減少促進細胞遷移和侵襲。乳腺癌、胃癌、胰腺癌Serpin A5PC1uPA、組織蛋白酶LPCI低表達與侵入性表型相關。PCI的增加可提高乳腺癌生存率。腎癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌Serpin E2PN-1uPA、tPAPN-1過表達具有抗血管生成的特性。前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、鱗狀細胞癌、血管癌Serpin I1NeuroserpinuPA、tPA、plasminNeuroserpin保護癌細胞,使其逃避腦內FasL介導的細胞死亡。中樞神經系統(tǒng)Serpin B5Maspin-Maspin抑制腫瘤細胞遷移,長期以來被認為是腫瘤抑制因子,但最近的研究駁斥了這種說法。乳腺癌Serpin F1PEDF-PEDF是一種強有力的抗血管生成和抗腫瘤藥物腦癌

3 小結與展望

Serpins在刺激或抑制腫瘤細胞遷移、侵襲和血管再生中扮演著重要的角色。因為抗蛋白水解作用并不是它們的唯一功能，其功能依賴于與其他蛋白的互作，Serpins在癌癥中的作用非常復雜。且從綜上所述來看，目前沒有一種Serpins能夠明確的被證明在惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲中具有抑制作用，7種Serpins在不同種類的惡性腫瘤研究結果中均出現有的抑制、有的促進的矛盾現象。同一種惡性腫瘤不同患癌方式，Serpins類蛋白表現的結果也不一樣。如Huang等[41]在2017年的研究結果顯示PAI-1是前列腺癌(PAC)的預后標志，但是在局限性前列腺癌沒有預后價值 。如此復雜多樣的作用結果與Serpins復雜的作用機理有關。7種Serpins在腫瘤中的作用總結結果見表1[5-40]。鑒于如此復雜的作用機理，對于絲氨酸蛋白酶抑制劑類蛋白在惡性腫瘤中的作用需要科研工作者繼續(xù)深入長期研究。

另外一個導致Serpins在腫瘤中復雜多樣的作用結果的原因是Serpins的底物基質金屬蛋白酶MMPs家族龐大且作用復雜，除了與上下游靶標作用影響腫瘤發(fā)生發(fā)展外，MMPs家族還會相互影響而促進或抑制腫瘤細胞的生物學進程，這一點加大了Serpins在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機理研究的復雜程度和難度。例如：在人類的23種MMPs家族中，黃紅顏等[42]研究發(fā)現MMP-11的表達抑制會導致 MMP-14 的表達抑制，兩者的表達抑制會減弱乳腺癌細胞的遷移和侵襲。但是Rio等[43]的研究卻顯示MMP-11 作為MMP-14的作用底物被剪切成許多小的片段游離于細胞質內，MMP-14 對MMP-11 進行負向調控而使其喪失活性。

總之，作為人體內源性絲氨酸蛋白酶的抑制劑Serpins能夠阻斷惡性腫瘤細胞在轉移與侵襲過程中uPA對MMPs的剪切與活化作用，直接抑制與阻斷惡性腫瘤細胞的轉移與侵襲作用這一理論使得Serpins成為有希望的抗腫瘤藥物是毋庸置疑的。且內源性物質這一特性更增加了Serpins相關臨床應用研發(fā)的可行性。目前討論較多的是可以作為腫瘤預后標志物識別患侵襲性腫瘤轉移的風險，作為一種生長因子和一些癌癥凋亡的抑制劑，也可以成為癌癥的治療靶點，還可以開發(fā)Serpins類抑制劑作為治療試劑。但Serpins作用機理非常復雜，目前研究多為初步研究，將其成功研發(fā)成為臨床腫瘤藥物需要科研工作者進一步揭示作用機理。