孫艷玲 謝 華 林洪麗 劉 穎 張圣坤
(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,大連116011)
特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人原發(fā)性腎病綜合征的主要病理類型,國外研究報道IMN的患病率占成人INS的25%~40%[1],而我國IMN的患病率以每年1.3%的速度升高并已達24.9%[2]。隨著血清PLA2R等特異性抗體的發(fā)現,IMN的發(fā)病機制有了新的進展,但目前仍建議激素聯合免疫抑制劑進行治療[3]。糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)是通過結合其特異受體糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)而發(fā)揮作用的,其中GRα和GRβ是影響其生物學效應的主要亞型,GRα由于其主導作用一直被認為是GC發(fā)揮作用的核心,但隨后的研究發(fā)現GRβ對GRα的潛在拮抗作用可能在激素抵抗眾多因素中占有主要地位,GRβ的高表達狀態(tài)可能與激素抵抗的發(fā)生過程有直接關系[4]。外周血單個核細胞(Peripheral blood mononclear cell,PBMC)中表達豐富的GR,本文通過檢測IMN患者發(fā)病和緩解時PBMC中GRα與GRβ的表達,分析其與IMN疾病活動的相關性,探尋能反映IMN激素治療的生物標志物。
1.1臨床資料 選擇2013年10月至2015年3月于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科經腎活檢確診為IMN的患者26例。所有入組患者均簽署知情同意書,并經過大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(注冊號:ChiCTR-RCH-13003503)。入選標準:①年齡:18~70歲;②血清白蛋白≤30 g/L,24小時尿蛋白定量≥3 500 mg;③eGFR>60 ml/(min·1.73 m2);④首次發(fā)病的IMN未應用激素或免疫抑制劑;⑤高血壓能夠有效控制≤130/80 mmHg或無高血壓;⑥服用ARB或ACEI藥物8周以上。排除標準:①各類繼發(fā)性膜性腎病,如過敏性紫癜性腎炎、糖尿病腎病、肝炎病毒相關性腎炎、狼瘡性腎炎以及腫瘤相關性腎病等;②合并中重度高血壓、心臟病、腦血管疾病、肝臟疾病、糖尿病、惡性腫瘤等其他疾病。
入組患者的治療方案:①激素序貫治療:年齡<60歲,予甲基強的松龍500 mg/d連續(xù)靜脈輸液3 d,續(xù)接強的松40 mg/d口服8周;年齡≥60歲,予甲基強的松龍250 mg/d連續(xù)靜脈輸液3 d,續(xù)接強的松30 mg/d 口服8周;此后以每半月減量2.5 mg至20 mg/d,維持8周。如達到完全緩解,繼續(xù)按照規(guī)律減量至5 mg/d后維持8周停藥;如未達到完全緩解,則20 mg/d維持12周,再按規(guī)律減量至10 mg/d。②聯合免疫抑制劑應用:在規(guī)律足量糖皮質激素治療8周后,聯合應用他克莫司,以0.05 mg/(kg·d)為起始量,監(jiān)測血藥濃度維持在4~7 ng/ml。
療效判定及隨訪:治療后尿蛋白定量≤300 mg/24 h,血清白蛋白≥35 g/L,血清肌酐正常為完全緩解(CR);治療后尿蛋白定量下降>50%,或尿蛋白定量降至3 500 mg/24 h,血清白蛋白≥35 g/L,血清肌酐正常為部分緩解(PR),總緩解(TR)= CR+PR;所有患者每月隨訪1次,到達CR的患者3個月隨訪1次。記錄患者隨訪過程中的24 h尿蛋白定量、血清白蛋白(ALB)、血脂、血清肌酐和血壓。
健康對照組:選擇來大連醫(yī)科大學附屬第一院進行健康體檢,經詢問病史、體格檢查、影像學及化驗等檢查確認為健康,年齡、性別與腎病綜合征組匹配的志愿者10例作為對照。
1.2方法
1.2.1標本采集、外周血單個核細胞(PMBC)的分離及總RNA提取 健康志愿者于入選后抽取空腹靜脈血12 ml,置于EDTA抗凝;腎病綜合征患者分別留取入組患者基線(激素治療前)、聯合應用免疫抑制劑前(規(guī)律糖皮質激素治療8周)、達到完全緩解或部分緩解時1周內的各抽取清晨空腹靜脈血12 ml,置于EDTA抗凝。密度離心法用人淋巴細胞分離液常規(guī)分離PBMC,Trizol法提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,紫外分光光度法測定RNA濃度和純度。
1.2.2RNA逆轉錄成cDNA 按SYBR?PrimeSc-riptTMMaster Mix ( Perfect Real Time )RT-PCR 試劑盒說明書進行反轉錄,反應體系組成:5×PrimeScript RTMaster Mix (2 μl)+ Total RNA(2 μl)+ RNase Free dH2O(6 μl),PCR儀運行程序37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃ 保存。
1.2.3實時熒光定量PCR 在primer bank中分別查得GRα、GRβ和GAPDH(內參)引物序列,并通過NCBI的Primer BLAST功能對引物進行驗證,由大連TaKaRa公司合成。GRα引物:上游5′-CTATGCATGAAGTGGTTGAAAA-3′,下游5′-TTTCAGCTAACAT-CTCGGG-3′;GRβ引物:上游5′-GAAGGAAACTCCAG-CCAGAA-3′,下游5′-CCACATAACATTTTCATG-CATAGA-3′;GAPDH引物:上游5′-AGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGC-TGTA-3′。PCR 反應按SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒說明書進行,采用熒光定量擴增儀LightCycler 使用方法進行操作,PCR 反應體系組成:2×SYBR?Premix Ex TaqTM(10 μl)+10 μmol/L PCR Forward Primer(0.8 μl)+10 μmol/L PCR Reverse Primer(0.8 μl)+Rox Refernce Dye(50×)(0.4 μl)+cDNA溶液(2 μl)+dH2O(6 μl)Q-PCR反應條件:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 循環(huán)。GRα和GRβ mRNA表達水平以GAPDH作為內參,以目的基因/GAPDH的比率作為其mRNA的表達量,所有實驗均重復3次,結果應用2-ΔΔCT法進行分析。
1.2.4Western blot分析 將收集的PBMC中加入冰冷蛋白裂解液200 μl,冰浴30 min,以1 200 r/min,4℃離心10 min。吸取上清,考馬斯亮藍G250檢測試劑盒法測定蛋白濃度。50 μg蛋白樣品上樣,SDS-PAGE凝膠電泳后分離蛋白,將蛋白轉移至PVDF膜上,3%BSA室溫封閉1.5 h,加一抗4℃振蕩過夜(稀釋GRα及GRβ兩種一抗終濃度為1∶500,GAPDH一抗稀釋的終濃度為1∶2 000),次日TBST洗膜,加辣根過氧化物酶標記的二抗(終濃度為1∶2 000),室溫孵育1.5 h,TBST洗膜,用含有辣根過氧化物酶底物的化學發(fā)光液顯色并掃描結果,通過UVP凝膠圖像處理系統Labworks4.6軟件掃描膠片,并分析目的條帶的灰度值進行半定量分析。
2.1IMN患者基線資料及隨訪資料 26例IMN患者男女比例為3∶1,進行12個月的隨訪,其中達到CR 9例,PR 6例,NR 11例,臨床緩解率為53.8%,隨訪過程中尿蛋白定量及血白蛋白的變化情況:根據t檢驗計算,基線時24 h尿蛋白定量為(8 409.56±2 810.01)mg,血清白蛋白為(23.49±4.50)g/L;激素治療8周時24 h尿蛋白定量為(4 855.91±1 894.00)mg,血清白蛋白為(27.85±3.88)g/L;總緩解時24 h尿蛋白定量為(871.76±1 044.03)mg,血清白蛋白為(39.83±6.83)g/L。
2.2qRT-PCR檢測GRα和GRβ mRNA表達變化 以GAPDH為參照,與Control組相比,IMN組PBMC中GRα的表達降低(P<0.05),而GRβ的表達明顯升高(P<0.05),如圖1所示。IMN組患者PBMC中GRα/GRβ較Control組明顯降低(P<0.05)。
激素治療8周的IMN患者GRα相對含量較基線時無明顯變化(P=0.916),緩解時GRα相對含量較基線時有所增加(P<0.05);激素治療8周的IMN患者GRβ相對含量較基線時有所增加(P<0.05),緩解時GRβ相對含量較基線時無明顯變化(P=0.172),如圖2所示。
2.3Western blot檢測GRα和GRβ蛋白的表達 以GAPDH為參照,統計學分析兩組樣本的表達差異,與Control組相比,IMN組GRα的表達無變化(P>0.05),而GRβ表達明顯增高(P<0.05),如圖3所示。
與基線組相比,激素治療8周時 GRα的表達無明顯變化(P=0.685),緩解時GRα的表達變化不明顯(P=0.674),緩解時GRα較激素治療8周時無明顯變化(P=0.419);與基線組相比,激素治療8周時GRβ的表達明顯升高(P<0.05),緩解時GRβ的表達不明顯(P=0.179),緩解時GRβ較激素治療8周時明顯下降(P<0.05),如圖4所示。
圖1 qRT-PCR檢測IMN組與Control組GRα和GRβ mRNA的表達Fig.1 qRT-PCR method detected expressions of GRα and GRβ mRNA of IMN patients and controls
圖2 qRT-PCR 檢測IMN患者GRα和GRβ基因的表達Fig.2 qRT-PCR method detected expressions of GRα and GRβ gene of IMN patientsNote: GC.Glucocorticoid,baseline;GC 8 weeks.Glucocorticoid treatment 8 weeks;TR(Total remission)=CR(Complete remission)+PR(Partial remission).
圖3 Western blot檢測GRα和GRβ蛋白的表達Fig.3 Western blot method detected expressions of GRɑ and GRβ protein of IMN patients and controls
圖4 Western blot檢測IMN患者GRα和GRβ蛋白的表達結果Fig.4 Western blot method detected expressions of GRα and GRβ protein of IMN patientsNote: GC.Glucocorticoid,baseline;GC 8 weeks.Glucocorticoid treatment 8 weeks;TR(Total remission)=CR(Complete remission)+PR(Partial remission).
表1 IMN患者臨床及病理指標與臨床緩解的COX回歸分析
Tab.1 COX regression analysis between clinical indexes,pathological indexes and clinical remission of IMN patients
Influence factorP for TrendGender0.444Age0.907Course of disease0.285Blood pressure0.43224 h urine protein0.404Serum albumin0.436Serum creatinine0.458Cholesterol0.373Triglyceride0.456Fibrinogen0.504Baseline of GRα mRNA0.022Baseline of GRβ mRNA0.915Baseline of GRα/β mRNA0.016Baseline of GRα0.516Baseline of GRβ0.623Baseline of GRα/β0.298
2.4COX回歸分析 生存分析結果顯示,年齡、病程、血壓、24 h尿蛋白定量、Alb、Scr、CH、TG、Fib、與臨床緩解無明顯相關性(P>0.05)。而基線時GRα基因表達P<0.05、基線時GRα/β基因表達P<0.05,提示其與臨床緩解相關如表1所示。
IMN患者很大程度上對激素存在抵抗,為改善激素抵抗患者的臨床效果及其預后,近年來關于IMN患者激素抵抗[5]的機制,始終是學者們研究的熱點問題。糖皮質激素首先需與GR結合而發(fā)揮生物學作用。有研究顯示,GRα和GRP具有協同作用,GRα與GRP比例失衡可能會導致激素反應性改變[6]。GRα能夠結合糖皮質激素發(fā)揮生理學、藥理學的作用,而GRβ可以抑制GRα的作用,從而阻止GRα發(fā)揮作用,兩者之間的比例也會影響糖皮質激素的作用[6]。
在所有被檢測的組織與細胞中,GRα蛋白幾乎均有表達[7],是介導GC發(fā)揮抗炎作用、引起免疫抑制反應的主要功能性受體,GC的療效與GRα的數量、GC與GR的親和力密切相關[8]。GRβ主要存在于細胞核內,多種細胞和組織中可以檢測到GRβ的表達,GRβ含有獨特的C端氨基酸序列,該序列使其無法結合GC配體,因此阻斷其直接激活基因的表達[4]。GRβ能夠降低GRα介導GC的生物學效應,首次提出了GRβ是一種內源性GC效應拮抗因子[9,10]。有學者檢測不同GC反應患者的PBMC細胞漿和細胞核中GR的表達水平,因此我們推斷激素抵抗的患者PBMC內可能存在GRα核轉位過程中的障礙,致使核內GRα水平無明顯增高,GC也就無從發(fā)揮其相應的作用,從而產生激素抵抗。針對IMN患者激素抵抗的分子機制目前仍然處于探索與假設的階段,其發(fā)病機制值得我們深入探討與研究。本次研究主要以基因及分子的表達水平為切入點來探討GRα及GRβ表達的變化與激素抵抗的相關性。
本次實驗分別從基因和蛋白水平對GRα與GRβ兩種主要亞型在PBMC內的表達差異進行分析。發(fā)現IMN組患者及Control組均有GRα mRNA和GRβ mRNA的表達,并且以GRα mRNA為主,其中IMN組的GRβ mRNA的表達與Control組相比明顯增高,GRα mRNA的表達與Control組相比明顯減低。比較GRα mRNA與GRβ mRNA的比值,可見IMN組GRα mRNA/GRβ mRNA較Control組降低,而GRβ mRNA/GRα mRNA增加,這進一步提示,GRβ mRNA表達的增高及GRβ mRNA/GRα mRNA的增高可能影響激素抵抗的形成過程。Western blot結果提示:IMN組患者PBMC內GRα蛋白的水平與Control組比較未見明顯改變,而GRβ蛋白的水平明顯增高,同樣支持GRβ的高表達可能為激素抵抗的因素之一。
COX回歸分析結果顯示,基線時α基因表達P=0.022<0.05;基線時β基因表達P=0.915;基線時α/β基因表達P=0.016<0.05,提示基線時基因α與α/β與臨床緩解呈相關性。本研究提示,無論IMN組患者GRβ的表達水平還是GRβ mRNA/GRα mRNA表達的比值,均高于Control組,因此提示GRβ的過表達可以導致IMN患者激素敏感性的下降,導致激素抵抗。這一結果提示阻斷GRβ mRNA的表達,可能成為治療IMN一種理想的免疫干預手段。因此,我們可以通過增強GRα與GC的親和力、降低GRβ受體的數量、提高GRα/GRβ等方式來減少患者的激素抵抗,提高臨床治療效果。