李宗祥 肖 凱

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，武漢430070)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以小關(guān)節(jié)為主的慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損傷的自身免疫性疾病，最終引起關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，是使患者喪失勞動力和致殘的疾病之一，給患者及其家庭帶來極大的痛苦和負(fù)擔(dān)[1-3]。在RA的發(fā)展過程中，抗炎因子和促炎因子的平衡是影響患者自身免疫、炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷的關(guān)鍵因素。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是一類廣泛表達(dá)于不同組織和細(xì)胞中的模式識別受體，不僅可以通過識別病原相關(guān)分子模式激活天然免疫，還可以通過刺激抗原呈遞細(xì)胞分泌炎癥因子調(diào)節(jié)獲得性免疫[4,5]。髓樣分化因子88(MyD88)依賴型TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β(Transformation growth factor β，TGF-β)和核因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子白介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、黏附分子以及干擾素的表達(dá)和釋放，加重對組織器官的損傷[6-8]。復(fù)方通痹膠囊為臨床常見的中藥復(fù)方制劑，有消腫止痛和祛風(fēng)除濕的作用，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕以及RA的治療，但其作用機(jī)制的研究仍相對缺乏[9,10]。目前根據(jù)造模物質(zhì)的不同，常見的RA模型有佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型(Adjuvant-induced arthritis，AA)、膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)和膠原抗體誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(Collagen antibody induced arthritis，CAIA)。其中CIA模型的組織和免疫學(xué)特征與人類RA的最接近，因此CIA模型廣泛用于RA的相關(guān)研究中。因此，為了進(jìn)一步闡明通痹膠囊在RA中的治療機(jī)制，本研究通過建立CIA模型，探究TLR4通路在通痹膠囊治療RA中的作用機(jī)制，為其臨床治療RA提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性Spraque-Dawley大鼠64只，體重(200±20)g，SPF級，購自湖北省實驗動物研究中心。所有大鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)條件為固定光照(12 h∶12 h/白天∶黑夜)，溫度(24±2)℃，濕度約30%，自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2實驗試劑 通痹膠囊由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院提供，批號：Z10960010。牛Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ,C Ⅱ)、完全弗氏佐劑(Complete fereund′s adjuvant，CFA)、雷公藤購自Sigma公司。4%多聚甲醛和蘇木精-伊紅染液購自北京艾德萊生物科技有限公司。BCA試劑盒購自ThermoFisher公司。大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TLR4(ab13556)、MyD88(ab2064)、NF-κB(ab131546)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組(Con，8只)和CIA模型組(40只)。將4 g/L的CⅡ型膠原和等量CFA混合均勻并使用均漿器乳化，將制備好的乳劑置于4℃保存?zhèn)溆谩IA模型動物分3點皮內(nèi)注射CⅡ/CFA乳劑，即背部靠近尾部左右2點分別注射0.2 ml，尾根部注射0.1 ml。7 d后采用同樣方法皮下注射0.1 ml CⅡ/CFA乳劑1次。正常對照組動物在相同部位等時間點注射等體積生理鹽水。

1.2.2實驗動物分組及處理 取造模14 d后成功的大鼠40只，隨機(jī)分為模型組(Mod)、陽性對照組(雷公藤處理，PC組，0.01 g/kg)、通痹膠囊0.075、0.150、0.300 g/kg劑量組(LD、MD、HD組)。每組8只。處理組以1 ml給藥體積/100 g體重灌胃相應(yīng)藥品，每天1次，連續(xù)給藥14 d。對照組和模型組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水。治療結(jié)束后使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，取關(guān)節(jié)滑膜組織至EP管中保存于-80℃?zhèn)溆?；取關(guān)節(jié)組織固定于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.3關(guān)節(jié)腫脹度檢測 使用大鼠足踝體積測量儀利用排水法檢測大鼠雙后足踝體積變化，整個實驗過程每7 d測量1次。采用同側(cè)足踝造模前后體積差值為關(guān)節(jié)腫脹度。

1.2.4HE染色觀察關(guān)節(jié)病理變化 將大鼠關(guān)節(jié)組織從4%多聚甲醛溶液中取出，并使用梯度濃度乙醇脫水，然后使用二甲苯透明、石蠟包埋、切片；隨后使用二甲苯對切片進(jìn)行脫蠟處理，蘇木精染色、1%鹽酸、乙醇分化20 s，流水沖洗2 min后使用0.5%伊紅染液染色，梯度乙醇脫水透明，封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.2.5ELISA檢測大鼠血液炎癥因子水平 使用尾靜脈采血方法采取大鼠血液，4℃靜置過夜后，3 500 r/min 離心5 min，取血清檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.6Western blot檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 取50 mg滑膜組織于2 ml EP管中并加入1 ml含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液以及2粒玻璃珠，勻漿器勻漿5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清并用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行定量。每組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)情況，以GAPDH作為定量分子標(biāo)記物，使用BandScan 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.7回補(bǔ)實驗 16只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(Con)、模型組(Mod)、0.300 g/kg通痹膠囊治療組(Hig)、通痹膠囊聯(lián)合TLR4激動劑處理組(單磷酰脂質(zhì)A，Monophosphoryl lipid A，MPLA，HIG+MPLA)，每組4只。實驗動物造模以及處理方式參考1.2.1與1.2.2。處理后檢測血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平和滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1通痹膠囊對大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響 采用排水法對各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。與正常對照組相比，模型組、陽性對照組和通痹膠囊各劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，陽性對照組和通痹膠囊高劑量組治療7 d和14 d后的關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低(P<0.05)。

2.2通痹膠囊對模型大鼠關(guān)節(jié)病理的影響 如圖2所示，正常對照組大鼠可見滑膜細(xì)胞排列整齊且無增生，血管分散分布，關(guān)節(jié)腔無滲出物，無浸潤的單核和淋巴細(xì)胞，關(guān)節(jié)表面光滑。模型組滑膜組織增生明顯，炎癥細(xì)胞浸潤，組織內(nèi)可見新生毛細(xì)血管增多以及散在分布的尚未形成管腔結(jié)構(gòu)的毛細(xì)血管，形成關(guān)節(jié)軟骨的破壞。陽性對照組和通痹膠囊高、中劑量用藥組治療后不同程度地抑制了滑膜組織的增生，降低炎癥細(xì)胞的浸潤。

圖1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化Fig.1 Changes of joint swelling in ratNote: Mean SD.n=6.*.P<0.05 vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖2 HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理變化Fig.2 Observation of histological changes of rat arthritis tissues by HE stainingNote: A.Control group;B.CIA model group;C.Positive control group;D.Tongbi capsule low dose group;E.Tongbi capsule middle dose group;F.Tongbi capsule high dose group.Arrow.Damage in cartilage;oval.damage in synovial.

2.3通痹膠囊對模型大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平影響 各組大鼠處理后血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平如圖3所示。與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和通痹膠囊高劑量組血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。實驗結(jié)果表明0.3 g/kg通痹膠囊處理14 d能顯著降低CIA大鼠血清炎癥因子的水平，從而降低炎性反應(yīng)水平。

2.4通痹膠囊對模型大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)影響 本研究使用Western blot檢測各組大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。與正常對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和通痹膠囊中、高劑量組滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB水平顯著降低(P<0.05)，且陽性對照組顯著低于通痹膠囊處理組。

2.5激活TLR4/MyD88信號通路可以抑制通痹膠囊對CIA大鼠的治療作用 為了驗證通痹膠囊可以通過抑制TLR4/MyD88信號通路發(fā)揮對CIA的治療作用，本研究使用通痹膠囊聯(lián)合TLR4/MyD88激動劑MPLA處理CIA大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPLA處理后顯著降低通痹膠囊對TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)的抑制作用，提高TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表達(dá)水平，見圖5。且激活TLR4/MyD88通路以后大鼠血清炎癥因子IL-6、 IL-1β、 TNF-α水平顯著高于通痹膠囊單獨處理組，見圖6，說明通痹膠囊可以通過抑制TLR4/MyD88信號通路治療RA。

圖3 大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平變化Fig.3 Levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat serumNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖4 大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平Fig.4 Protein levels of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissuesNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖5 抑制TLR4通路對大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of protein expression of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissues by inhibited TLR4 pathwayNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;HD.Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA.Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

圖6 抑制TLR4通路對大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平影響Fig.6 Effect of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat by inhibited TLR4 pathwayNote: CON:control group;MOD:CIA model group;HD:Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA:Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

3 討論

RA是一種致病機(jī)制較為復(fù)雜且難以治愈的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此至今尚無特效療法[11]。疼痛和炎癥是RA的兩大主要癥狀，現(xiàn)行RA的治療也是通過減輕關(guān)節(jié)組織的炎性反應(yīng)，達(dá)到修復(fù)關(guān)節(jié)損傷、降低痛疼、緩解癥狀的目的[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通痹膠囊能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)組織損傷，以及降低大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

RA患者病灶局部發(fā)生T細(xì)胞浸潤，大量分泌IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子。IL-1β可以通過刺激淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞釋放金屬蛋白酶和機(jī)制溶素，破壞軟骨基質(zhì)[13]。IL-6作為一種促炎因子可以通過增加IL-1β和TNF-α的一些生物效應(yīng)的放大因子，誘導(dǎo)肝臟合成類風(fēng)濕因子[14]。RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，是由于風(fēng)、寒、濕和熱等外邪侵襲人體導(dǎo)致的麻木、屈伸不利和關(guān)節(jié)腫大等癥狀。通痹膠囊具有解表除濕、祛風(fēng)散寒、活血化瘀、抗炎和鎮(zhèn)痛的作用[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.300 g/kg通痹膠囊治療14 d后大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織損傷顯著減輕，且炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平也顯著降低，說明通痹膠囊能夠顯著抑制CIA大鼠的炎性反應(yīng)，減輕炎癥損傷。吳德松等[16]研究也證實通痹膠囊具有明顯的鎮(zhèn)痛以及抗RA活性。王曉磊等[9]在治療RA的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)通痹膠囊對于改善RA患者的關(guān)節(jié)功能具有良好療效，且能夠顯著降低患者外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

TLR是一類啟動天然免疫的細(xì)胞表面信號傳導(dǎo)受體蛋白，在自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。TLR4是天然免疫系統(tǒng)識別病原體的主要受體，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞表面，與慢性炎癥、自身免疫疾病以及腫瘤的發(fā)生相關(guān)。TLR4可以通過MyD88依賴和MyD88非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)NF-κB活化，從而活化炎性反應(yīng)，引起IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)級聯(lián)炎性反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示，通痹膠囊治療后大鼠關(guān)節(jié)組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平顯著降低，說明通痹膠囊顯著抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而抑制炎癥因子的釋放，改善RA癥狀[18]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)激活TLR4/NF-κB信號通路以后能夠顯著抑制通痹膠囊誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低。

綜上所述，本研究以膠原誘導(dǎo)型RA模型為基礎(chǔ)，通過病理學(xué)觀察和免疫學(xué)檢測，證實通痹膠囊可以通過抑制TLR4/NF-κB通路的異常激活，降低炎癥因子的釋放，顯著改善RA的炎性反應(yīng)。