葉開(kāi)，余佳紅，陳天琰，高建一，張磊，胡嘉波

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)損傷中，神經(jīng)元不可再生，軸突再生是神經(jīng)功能恢復(fù)的基礎(chǔ)過(guò)程［1］。施萬(wàn)細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，沿著神經(jīng)元軸突分布，參與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)纖維的構(gòu)成，分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以維持受損的神經(jīng)元存活并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)而達(dá)到外周神經(jīng)再生的目的［2］。微囊泡是來(lái)源于親本細(xì)胞的微小膜性細(xì)胞器，其在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移胞質(zhì)內(nèi)容物，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA等［3］。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 43（growth associated protein 43，GAP43）是神經(jīng)元發(fā)育和軸突再生過(guò)程中的一種重要蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)突向外生長(zhǎng)和神經(jīng)元生長(zhǎng)，對(duì)突起發(fā)育形成起重要調(diào)控作用［4］。施萬(wàn)細(xì)胞微囊泡可能對(duì)神經(jīng)再生，尤其是對(duì)軸突再生［5］具有重要意義，但臨床上人神經(jīng)干細(xì)胞源施萬(wàn)樣細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱施萬(wàn)樣細(xì)胞）來(lái)源受限［6］，且對(duì)軸突的再生作用尚不清楚。因此，本研究從SD大鼠乳鼠提取背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG），試用施萬(wàn)樣細(xì)胞分泌的微囊泡刺激DRG神經(jīng)元及神經(jīng)元樣N2a細(xì)胞株，觀察施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡對(duì)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)及GAP43 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)SD雄性大鼠1只，出生4～5 d，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：201822045。N2a細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)；人源神經(jīng)干細(xì)胞由課題組先前實(shí)驗(yàn)所得［7］。

DMEM（美國(guó)Gibco公司）；DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基：Neurohasal培養(yǎng)基+2%B27添加劑（美國(guó)Gibco公司）+100μg/L神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子+2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國(guó)Sigma公司）；抗有絲分裂DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基：DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基+10μmol·L-1阿糖胞苷（上海源葉公司）；施萬(wàn)樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM/F12+10%無(wú)微囊泡胎牛血清（4℃行100 000×g離心12 h獲得，美國(guó)Gibco公司）+5μg/L血小板衍生因子-BB+10μg/L重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子+200μg/LHeregulin-1β（HRG-1β）+5μmol/L弗斯可林（美國(guó) PeproTech公司）；基質(zhì)膠（美國(guó)Coring公司）；Ⅰ型膠原酶（上海源葉公司）；35μg/L全反式維甲酸、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰酶、乙二胺四乙酸、細(xì)胞膜染劑PKH67試劑盒、牛血清白蛋白、曲拉通100（美國(guó) Sigma公司）；S100β一抗（1∶50）、DAPI（武漢博士德公司）；βⅢ-微管蛋白一抗（1∶300，鎮(zhèn)江愛(ài)必夢(mèng)生物技術(shù)公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；Cy3TM-熒光二抗（1∶500，美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司）；過(guò)碘酸-雪夫染色試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司）；cDNA合成試劑盒（北京全式金生物公司）；熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；多維全景流式細(xì)胞儀（Flow Sight，美國(guó) Merck Millipore公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；納米顆粒跟蹤分析儀（英國(guó)NanoSight公司）。

1.2 施萬(wàn)樣細(xì)胞免疫熒光染色和N2a細(xì)胞培養(yǎng)

施萬(wàn)樣細(xì)胞由人源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)，參考Zheng等［8］方法。將人源神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于施萬(wàn)樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下誘導(dǎo)分化2周，獲得施萬(wàn)樣細(xì)胞；行S100β免疫熒光染色：4%低聚甲醛固定細(xì)胞20 min；于37℃用2%牛血清白蛋白和0.1%曲拉通100透化封閉1 h；加入抗S100β，4℃孵育過(guò)夜；棄一抗，避光加入Cy3TM_熒光二抗，37℃溫育2 h；棄二抗，PBS沖洗3遍；加入DAPI常溫放置10min；甘油封片；用倒置熒光顯微鏡捕獲圖。

DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基中維持N2a細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 DRG神經(jīng)元原代培養(yǎng)及純化

參考文獻(xiàn)［9］實(shí)驗(yàn)方法，如圖1所示，從SD大鼠乳鼠脊髓與坐骨神經(jīng)交界的膨大處摘取DRG，轉(zhuǎn)移至離心管，4℃900 r/min離心5 min；棄上清液，加入3 g/LⅠ型膠原酶2 mL，37℃孵育30 min；4℃900 r/min離心5 min；棄上清液，加入0.25%胰酶+乙二胺四乙酸2 mL，37℃孵育20 min；加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，4℃ 900 r/min離心5 min；取沉淀，接種于預(yù)先已包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿，加入抗有絲分裂DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基純化48 h；更換為DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖1 DRG原位觀察

1.4 微囊泡的分離及其納米顆粒跟蹤分析

參考Ji等［10］方法，將施萬(wàn)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基于4℃行2 000×g離心20 min，以除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)；然后，4℃行100 000×g離心70 min；棄上清液，用PBS洗滌沉淀；以相同方式進(jìn)行第2次超離心并重復(fù)2次；棄上清液，加入100μL PBS重懸沉淀。BCA法檢測(cè)施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡的蛋白質(zhì)含量（濃度為1 mg·mL-1）。將微囊泡注入儀器樣品室并通過(guò)納米顆粒跟蹤分析軟件分析（Version 2.3 Build 0006 BETA2）。

1.5 DRG神經(jīng)元βⅢ-微管蛋白檢測(cè)

取“1.3”中DRG神經(jīng)元，分2組，PBS組：加40μL PBS，用DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基補(bǔ)至2 mL；微囊泡組：加1 mg·mL-1施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡40μL，用DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基補(bǔ)至2 mL（終濃度：20μg/mL）；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)36 h；行βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色（方法同“1.2”），倒置顯微鏡下獲取圖像，Image J 1.48軟件計(jì)算軸突長(zhǎng)度。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)N2a細(xì)胞GAP43 mRNA表達(dá)水平

計(jì)數(shù)1×105個(gè)N2a細(xì)胞，接種于6孔板，撤離血清饑餓12 h；分別加入1 mg/mL施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡 0、10、40、80μL，用 Neurohasal培養(yǎng)基+20 ng/L神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子補(bǔ)齊至2 mL（終濃度為0、5、20、40 mg/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，刺激19 h；按照RNA提取步驟提取N2a細(xì)胞RNA，DNA酶處理后以25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2μL cDNA以20μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃初始酶活化2 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算每個(gè)樣品的2-△△Ct，獲得相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，每次實(shí)驗(yàn)取3次平均值。相關(guān)特異性引物見(jiàn)表1。

表1 寡核苷酸引物序列

1.7 施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡PKH67標(biāo)記和檢測(cè)

將20μL施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡與PKH67染料按試劑說(shuō)明書(shū)溶于1 000μL PBS，37℃溫育30 min；加1%牛血清白蛋白溶液終止反應(yīng)，4℃行10 000×g離心70 min；棄上清液，PBS清洗2～3遍。PKH67標(biāo)記的施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡與N2a細(xì)胞孵育48 h；PBS洗滌3遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)N2a細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。

1.8 N2a細(xì)胞過(guò)碘酸-雪夫染色

計(jì)數(shù)1×105個(gè)N2a細(xì)胞，接種于6孔板，撤離血清饑餓12 h；分別加入1 mg/mL施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡0、40、80μL，用Neurohasal培養(yǎng)基+20 ng/L神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子補(bǔ)齊至 2 mL（終濃度為0、20、40 mg/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，刺激48 h；行過(guò)碘酸-雪夫染色：固定液固定10min；PBS沖洗3遍；滴加試劑A（過(guò)碘酸溶液）覆蓋培養(yǎng)皿底部即可、避光室溫放置5～8 min；PBS沖洗3遍；滴加等量試劑B（品紅醛），避光室溫放置10～20 min；PBS沖洗3遍；滴加等量試劑 C（蘇木素染色液），染色1～2 min；滴加等量試劑D（酸性乙醇分化液）2～3 s；PBS沖洗3遍，直至液體顏色變淺；75%乙醇脫色至無(wú)色。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色及形態(tài)，并獲取圖像，Image J 1.48軟件計(jì)算N2a細(xì)胞突起長(zhǎng)度。突起增長(zhǎng)率：（刺激后細(xì)胞突起長(zhǎng)度-刺激前細(xì)胞突起長(zhǎng)度）/刺激前細(xì)胞突起長(zhǎng)度×100%；細(xì)胞陽(yáng)性率：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%（每組計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 施萬(wàn)樣細(xì)胞形態(tài)及DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)

倒置顯微鏡下觀察顯示，施萬(wàn)樣細(xì)胞呈現(xiàn)典型兩極或三極梭狀，S100β免疫熒光染色呈陽(yáng)性；DRG神經(jīng)元12 h內(nèi)貼壁，用DRG神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，可見(jiàn)大量軸突從神經(jīng)元團(tuán)塊中延伸出，見(jiàn)圖2。

圖2 施萬(wàn)樣細(xì)胞S100β染色和DRG神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)（×40）

2.2 微囊泡的形態(tài)及粒徑分析

在納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)下，施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡的形態(tài)為不同大小的粒子，其直徑分布為50～1 000 nm范圍內(nèi)，其中以100～300 nm居多，見(jiàn)圖3。

2.3 微囊泡促進(jìn)DRG神經(jīng)元βⅢ-微管蛋白表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果表明，DRG神經(jīng)元軸突的βⅢ-微管蛋白表達(dá)陽(yáng)性，與PBS組比較，施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡作用后的DRG神經(jīng)元新生軸突長(zhǎng)度明顯增加（t=9.794，P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.4 微囊泡上調(diào)N2a細(xì)胞GAP43表達(dá)

與0 mg/L組相比，5 mg/L組GAP43 mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.700 3，P＞0.05），20 mg/L組及40 mg/L組GAP43 mRNA表達(dá)明顯增加（q=5.374，16.820，P均＜0.05），且呈一定的濃度依賴效應(yīng)。見(jiàn)圖5。

圖3 施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡的形態(tài)及粒徑分析

圖4 DRG神經(jīng)元βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色（×40）

圖5 qRT-PCR檢測(cè)各組N2a細(xì)胞GAP43 mRNA的表達(dá)

2.5 N2a細(xì)胞吞噬微囊泡

PKH67標(biāo)記的施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡與N2a細(xì)胞孵育后，在N2a細(xì)胞胞體中可見(jiàn)PKH67綠色熒光。見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)N2a細(xì)胞內(nèi)熒光

2.6 微囊泡促進(jìn)N2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)及糖原生成

與0 mg/L組相比，20、40 mg/L組 N2a細(xì)胞突起增長(zhǎng)率均明顯增加（q=5.229，17.580，P均＜0.05），其過(guò)碘酸-雪夫染色后的陽(yáng)性細(xì)胞也隨之明顯增多（q=5.666，20.10，P均＜0.05）。見(jiàn)圖7和圖8。

圖7 各組N2a細(xì)胞過(guò)碘酸-雪夫染色（×200）

3 討論

大量證據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)不同的細(xì)胞間通訊機(jī)制支持軸突再生，除了細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制外，通過(guò)細(xì)胞外微囊泡的細(xì)胞間通訊已成為一種新的形式［11］。人神經(jīng)干細(xì)胞的微囊泡對(duì)坐骨神經(jīng)的修復(fù)有促進(jìn)作用。施萬(wàn)細(xì)胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育緊密聯(lián)系［12］。本實(shí)驗(yàn)表明，人神經(jīng)干細(xì)胞源施萬(wàn)細(xì)胞通過(guò)分泌微囊泡對(duì)神經(jīng)的再生，尤其是神經(jīng)元軸突的再生有促進(jìn)作用。

圖8 各組N2a細(xì)胞突起增長(zhǎng)率和過(guò)碘酸-雪夫染色細(xì)胞陽(yáng)性率比較

我們的前期實(shí)驗(yàn)參考Zheng等［8］方法已成功獲取施萬(wàn)樣細(xì)胞，其具有傳統(tǒng)施萬(wàn)細(xì)胞的形態(tài)特征，并在體外可至少存活18代；S100β蛋白是主要存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)施萬(wàn)細(xì)胞中的特異性蛋白質(zhì)［13］。結(jié)果顯示，S100β蛋白在施萬(wàn)樣細(xì)胞中幾乎均為陽(yáng)性，并表達(dá)施萬(wàn)細(xì)胞多種特異性蛋白（數(shù)據(jù)未顯示）。

DRG主要由周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)感覺(jué)神經(jīng)元構(gòu)成，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單經(jīng)典，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)組織工程、干細(xì)胞治療等方面［14］。DRG的取材來(lái)自于各個(gè)年齡段的大鼠，包括胎鼠、乳鼠及成年大鼠。成年大鼠的DRG神經(jīng)元相對(duì)成熟且活性較低，胎鼠取材難度相對(duì)較大且耗時(shí)長(zhǎng)?？紤]實(shí)驗(yàn)的可行性和方便性，我們采用方便操作、DRG活性較高的出生4～5 d乳鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取材過(guò)程在4℃、30 min內(nèi)完成，保證DRG神經(jīng)元在體外的活性［15］。βⅢ-微管蛋白是神經(jīng)元發(fā)育和軸突再生過(guò)程中的特異性骨架蛋白，通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)可觀測(cè)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)和再生情況［16］。由于軸突密度數(shù)量較大，難以實(shí)現(xiàn)定量統(tǒng)計(jì)，而本研究免疫熒光結(jié)果可鑒定體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，同時(shí)對(duì)軸突的平均長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析，施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡刺激后的DRG神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度更長(zhǎng)，說(shuō)明施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡可促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。

神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響因素諸多，例如，不同批次的大鼠DRG的活性，取材手法的差異等，都是實(shí)驗(yàn)研究的不穩(wěn)定因素。因此，以神經(jīng)元樣細(xì)胞株N2a為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也證明N2a神經(jīng)元胞體及軸突可吞噬內(nèi)化微囊泡［17］。本研究結(jié)果顯示，施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡同樣可以進(jìn)入神經(jīng)元樣N2a細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞膜染料PKH67熒光信號(hào)的檢測(cè)會(huì)有放散效果，所以熒光信號(hào)的形狀大小并不能完全代表微囊泡的實(shí)際大小，可基本判斷N2a細(xì)胞中的綠色熒光即為PKH67標(biāo)記的施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡。施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡刺激N2a細(xì)胞19 h時(shí)，N2a細(xì)胞GAP43 mRNA表達(dá)量明顯增加。施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡濃度在5 mg/L時(shí)未促進(jìn)N2a細(xì)胞GAP43 mRNA表達(dá)增加，而濃度為20、40 mg/L時(shí)促進(jìn)GAP43 mRNA表達(dá)增加，由此說(shuō)明低濃度微囊泡可能對(duì)N2a細(xì)胞突起的形成無(wú)明顯效果，故后續(xù)N2a細(xì)胞突起形成實(shí)驗(yàn)和過(guò)碘酸-雪夫染色中，微囊泡濃度均用 0、20、40 mg/L。過(guò)碘酸-雪夫染色用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖原［18］。本實(shí)驗(yàn)N2a細(xì)胞的過(guò)碘酸 雪夫染色結(jié)果表明，施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡可促進(jìn)N2a細(xì)胞內(nèi)糖原生成。糖原代謝對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程起重要作用，糖原在神經(jīng)系統(tǒng)中用于產(chǎn)生乳酸，在神經(jīng)系統(tǒng)受損期間維持神經(jīng)元存活及神經(jīng)修復(fù)［19］?，F(xiàn)已證明施萬(wàn)細(xì)胞的微囊泡可作為載體，降低軸突生長(zhǎng)錐中GTP酶RhoA活性，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的軸突再生［4］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)人源的施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的同時(shí)，也可促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)糖原的生成，而神經(jīng)元的糖原代謝與軸突生長(zhǎng)間的具體聯(lián)系尚不清楚，以及施萬(wàn)樣細(xì)胞微囊泡是否通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元的糖原代謝而促進(jìn)軸突再生，還有待進(jìn)一步研究。