邵琦，李佳麗，周李寧，蘇兆亮，許化溪

（江蘇大學醫(yī)學院，鎮(zhèn)江江蘇212013）

巨噬細胞是高度異質(zhì)性的細胞群體［1］，參與抗原呈遞、吞噬和其他免疫調(diào)節(jié)過程［2］。浸潤到實體腫瘤的巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在不同因素的刺激下可分化為M1型或M2型巨噬細胞［3-4］。M1型巨噬細胞分泌促炎性細胞因子和趨化因子（如TNF-α、IL-12等），并能清除破壞吞噬腫瘤細胞。M2型巨噬細胞分泌抑炎性細胞因子（如IL-4，IL-8，IL-10等）下調(diào)免疫應答［5］。研究表明 TAMs更傾向于M2表型［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞通過炎癥反應促進腫瘤發(fā)生［7］，通過增加血管的生成、免疫抑制、侵襲等促進腫瘤轉(zhuǎn)移［8］，且TAMs與乳腺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥的總體低生存率相關(guān)［2］。人參炔醇是天然存在的聚乙炔［9］，能明顯抑制胰腺癌、肺癌［10］以及白血病［11］等多種腫瘤細胞增殖。然而，其對TAMs的作用尚不清楚，本研究旨在探討人參炔醇對巨噬細胞調(diào)控及其對乳腺癌細胞行為學的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人參炔醇（成都瑞芬思生物科技公司）；小鼠4T1乳腺癌細胞系和鼠源RAW264.7巨噬細胞系（上海中科院細胞庫）；RPMI-1640、DMEM和胎牛血清（美國Gibco公司）；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RIPA裂解液、結(jié)晶紫染液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗鼠精氨酸酶1（Arg-1）單克隆抗體、兔抗鼠誘導型一氧化氮合酶（iNOS）單克隆抗體、大鼠抗小鼠Bax單克隆抗體、大鼠抗小鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗小鼠caspase3單克隆抗體、兔抗小鼠cleaved-caspase3單克隆抗體、兔抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體等（美國Immunoway公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；Annexin-V/7-AAD凋亡試劑盒、PE標記的MHCⅡ類分子、CD80單克隆抗體、FITC標記的CD86單克隆抗體（美國 BD公司）；Arg-1、iNOS、IL-4、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α等PCR引物由生工生物公司設(shè)計并合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

4T1細胞、RAW264.7細胞分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每24 h換液1次；待細胞狀態(tài)良好，且生長密度在80%左右時傳代；取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 人參炔醇處理后4T1細胞生物學行為的改變

1.3.1 CCK-8檢測4T1細胞增殖 取對數(shù)生長期4T1細胞接種于96孔板，5×103/孔；待其穩(wěn)定貼壁后，以不同濃度人參炔醇（0、8、16μg/mL）分別處理6、12、24 h；棄上清液，PBS洗1遍；每孔加入100μL CCK-8與不含胎牛血清RPMI-1640的混合液（1∶9）；設(shè)置對照孔（含細胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液）和空白孔（只含培養(yǎng)基和CCK-8溶液），于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中避光孵育1～4 h；酶標儀測450 nm處D值。細胞增殖率按以下公式計算：細胞增殖率=（實驗孔D值-空白D值）/（對照孔D值-空白孔D值）×100%。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測4T1細胞凋亡比例 取對數(shù)生長期4T1細胞種于24孔板，2×105/孔，分別以不同濃度人參炔醇（0、8、16μg/mL）處理24 h；收集各組細胞，500×g離心5 min；棄上清液，用PBS洗滌，并以100μL緩沖液重懸；每組細胞按步驟說明分別加入5μL Annexin-V-APC和10μL 7-AAD，混勻，室溫避光染色15 min；加入380μL緩沖液終止反應；15 min內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測4T1細胞凋亡相關(guān)蛋白表達 前期處理同“1.3.2”，收集細胞后，加入RIPA裂解液，獲得蛋白樣本，檢測每個樣本的蛋白濃度，以保證每組所加蛋白樣本內(nèi)參量相同。蛋白行SDS-PAGE（80 V電泳20～30min，120 V電泳90min）；轉(zhuǎn)移至PVDF膜（350 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min）；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；將稀釋好的Bcl-2、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、β-肌動蛋白一抗于4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；加入稀釋二抗室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次10 min；根據(jù)檢測試劑盒步驟進行曝光顯色。一抗稀釋比：Bcl-2、Bax為1∶100，caspase3、cleaved-caspase3為1∶800，β-肌動蛋白為1∶800；二抗稀釋比均為1∶2 000。

1.3.4 Transwell檢測4T1細胞的遷移及侵襲作用在Transwell小室的下室中分別加入700μL由含10%胎牛血清RPMI-1640稀釋的不同濃度人參炔醇（0、8、16μg/mL），4T1細胞種于上室（1×104個/孔，侵襲實驗預鋪基質(zhì)膠，基質(zhì)膠稀釋倍數(shù)為1∶80），并加入 300μL無血清 RPMI-1640，放入細胞培養(yǎng)箱孵育24 h；用4%低聚甲醛固定10 min；結(jié)晶紫染色30 min；于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 RAW264.7巨噬細胞分組及相關(guān)指標的具體檢測

1.4.1 細胞分組 將RAW264.7巨噬細胞分為6組：①對照組，未處理；②脂多糖組，以500 ng/mL脂多糖刺激24 h；③IL-4組，以20 ng/mL IL-4刺激24 h；④CM組，以腫瘤培養(yǎng)上清液（CM）刺激48 h；⑤ CM+8組，以腫瘤培養(yǎng)上清刺激48 h，加8μg/mL人參炔醇處理24 h；⑥CM+16組，以腫瘤培養(yǎng)上清液刺激48 h，加16μg/mL人參炔醇處理24 h。

1.4.2 qRT-PCR檢測RAW264.7巨噬細胞中多種mRNA的表達 提取“1.4.1”各組細胞RNA，測定各組RNA濃度，根據(jù)試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別加入PCR反應試劑及 Arg-1、iNOS、IL-4、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α引物，以 β-肌動蛋白為內(nèi)參，分析比較各組mRNA表達。β-肌動蛋白引物序列：上游5′-GAAGTCCCTCACCCTCCCAA-3′，下游5′-GGCA-TGGACGCGACCA-3′；Arg-1引物序列：上游5′-GAAGAACCCACGGTCTGTGG-3′，下游5′-TCCAAC-TGCCAGACTGTGGTC-3′；iNOS引物序列：上游5′-CCCTGGTGCAGGGAATCTT-3′，下游5′-TAGCTGCCGCTCTCATCCA-3′；IL-1β引物序列：上游5′-GCAGAGCACAAGCCTGTCTTCC-3′，下游5′-ACCTGTCTTGGCCGAGGACTAAG-3′；IL-4引物序列：上游5′-ACAGGAGAAGGGACGCCATG-3′，下游5′-TGGAAGCCCTAGAGACGAGC-3′；IL-8引物序列：上游5′-CTGTTGGCCCAATTACTAACAG-3′，下游5′-TCCCGAATTGGAAAGGGAAATA-3′；IL-10引物序列：上游5′-TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC-3′，下游5′-GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG-3′；TNF-α引物序列：上游5′-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3′，下游5′-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′。反應條件：95℃預變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。每組樣本設(shè)置3個復孔。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表面抗原遞呈相關(guān)分子表達 收集各組細胞，分兩大組并分別以100μL PBS重懸，第一大組的6管標本加入1μL PE標記的MHCⅡ流式抗體，第二大組的6管標本分別加入1μL PE標記的抗CD80、FITC標記的抗CD86流式抗體；4℃避光孵育30 min；用1 mL PBS洗滌1次；加入200μL PBS重懸；用流式細胞儀檢測。

1.4.4 Transwell實驗檢測4T1細胞遷移與侵襲接種6組細胞于24孔板（2×105/孔，700μL）；取對數(shù)生長期的4T1細胞種于上室（1×104個/孔，侵襲實驗預鋪基質(zhì)膠，基質(zhì)膠稀釋比例為1∶80）；加入300μL無血清1640培養(yǎng)液于細胞培養(yǎng)箱孵育。檢測方法同“1.3.4”。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 5.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和制圖，多組計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用t檢驗，所有實驗均重復3次以上，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人參炔醇直接抑制4T1細胞增殖、遷移、侵襲行為

與0μg/mL組相比，人參炔醇處理組4T1細胞增殖受到明顯抑制，呈時間和劑量依賴。與0μg/mL組相比，8μg/mL、16μg/mL組6 h、12 h、24 h細胞增殖率明顯降低（P均＜0.01，圖1）；蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，與0μg/mL組相比，8μg/mL、16μg/mL組促凋亡蛋白Bax以及活化的cleaved-caspase3表達升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低（圖2）；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與0μg/mL組相比，8μg/mL、16μg/mL組細胞凋亡率明顯增加（t=51.12，25.37，P均＜0.01，圖3）；Transwell實驗結(jié)果顯示，與0μg/mL組相比，8μg/mL、16μg/mL人參炔醇處理組發(fā)生遷移侵襲的腫瘤細胞數(shù)量明顯減少（圖4）。

2.2 人參炔醇調(diào)節(jié)巨噬細胞 Arg-1，iNOS表達，誘導M2型巨噬細胞向M1型分化

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，CM組巨噬細胞呈現(xiàn)Arg-1（high）iNOS（low）表型。隨著人參炔醇濃度的升高，即CM+8組與CM+16組巨噬細胞中Arg-1 mRNA表達較 CM組明顯降低（t=7.087，11.51，P＜0.01），iNOSmRNA表達明顯升高（t=81.80，12.63，P＜0.01）。見圖5。

圖1 不同濃度人參炔醇處理乳腺癌4T1細胞不同時間后的細胞增殖率

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測不同濃度人參炔醇作用后乳腺癌細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

圖3 流式細胞術(shù)檢測不同濃度人參炔醇作用后乳腺癌4T1細胞凋亡比例

圖5 qRT-PCR檢測巨噬細胞Arg-1 mRNA和iNOSm RNA表達水平

2.3 人參炔醇上調(diào)巨噬細胞表面抗原遞呈相關(guān)分子，同時改變其分泌譜

2.3.1 人參炔醇上調(diào)巨噬細胞表面MHCⅡ類分子、CD80、CD86表達 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與CM組相比，CM+8組與CM+16組巨噬細胞表面抗原遞呈相關(guān)分子MHCⅡ類分子、CD80、CD86表達升高（圖6）。

2.3.2 人參炔醇改變巨噬細胞細胞因子分泌譜qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，CM組巨噬細胞分泌譜呈現(xiàn) TNF-α（low）、IL-1β（low）、IL-4（high）、IL-8（high）、IL-10（high）。與CM組相比，CM+16組 IL-4、IL-8、IL-10等mRNA表達水平明顯降低（P均＜0.05），IL-1β、TNF-α等mRNA表達水平明顯升高（P均＜0.05），細胞因子分泌譜轉(zhuǎn)為TNF-α（high）、IL-1β（high）、IL-4（low）、IL-8（low）、IL-10（low）。見圖7。

2.4 經(jīng)人參炔醇處理的巨噬細胞抑制4T1細胞的遷移與侵襲行為

實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，CM組巨噬細胞組遷移與侵襲到下室的4T1細胞數(shù)量明顯增加，隨著人參炔醇濃度升高，遷移與侵襲到下室的4T1細胞數(shù)量逐漸減少，濃度為16μg/mL時，4T1細胞數(shù)量減少量最為明顯（圖8）。

圖6 流式細胞術(shù)檢測RAW 264.7巨噬細胞抗原遞呈相關(guān)分子表達

圖7 qRT-PCR檢測巨噬細胞分泌譜mRNA水平表達

圖8 Transwell實驗檢測各組4T1細胞的遷移與侵襲（100×）

3 討論

人參炔醇為天然的聚乙炔醇類化合物，可通過阻滯細胞周期、干擾DNA合成抑制多種癌細胞增殖［12］。人參炔醇可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達誘導或加速腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本研究顯示，人參炔醇可以抑制4T1乳腺癌細胞系的增殖活動并觸發(fā)胞內(nèi)凋亡程序，在其作用下，促凋亡蛋白 Bax、cleaved-caspase3表達明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白表達顯著下降；同時對4T1細胞的遷移侵襲行為也起到明顯的抑制作用。由此說明，人參炔醇可經(jīng)由某種機制參與4T1細胞遠處轉(zhuǎn)移及侵襲的負向調(diào)節(jié)。

腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞多以 M2型存在［13］，TAMs與腫瘤相互作用，可分泌表皮細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子等多種細胞因子和CXCL、CCL趨化因子家族促進腫瘤生長，血管淋巴管生成和轉(zhuǎn)移［14］；在腫瘤發(fā)展過程中，TAMs又能產(chǎn)生多種降解消化基質(zhì)的酶，為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件［15］。同時，巨噬細胞可以通過減少抗原遞呈，阻礙T細胞增殖，抑制NK細胞的遷移來抑制免疫應答［16］。目前針對巨噬細胞的治療方式多分為三大類：逆轉(zhuǎn)TAMs表型（如陽離子聚合劑［17］）由促腫瘤表型向抗腫瘤表型分化；削弱TAMs對腫瘤的促進作用；殺傷 TAMs（如抗 CSF1R單克隆抗體［2］、氯膦酸鹽脂質(zhì)體［18］）。本研究結(jié)果顯示，人參炔醇對巨噬細胞系本身的活性并無影響，在已用腫瘤培養(yǎng)上清液體外誘導成M2表型的TAMs中加入人參炔醇后，巨噬細胞由 Arg-1（high）iNOS（low）的M2型轉(zhuǎn)化為Arg-1（low）iNOS（high）的M1型，且細胞表面抗原遞呈相關(guān)分子MHCⅡ類分子CD80、CD86的表達顯著升高，細胞因子分泌譜由 TNF-α（low）、IL-1β（low）、IL-4（high）、IL-8（high）、IL-10（high）轉(zhuǎn) 變 為TNF-α（high）、IL-1β（high）、IL-4（low）、IL-8（low）、IL-10（low），均提示巨噬細胞向 M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果聯(lián)合證明，人參炔醇可逆轉(zhuǎn)巨噬細胞表型、調(diào)節(jié)其抗原遞呈功能及細胞因子分泌譜。

綜上所述，體外實驗證實人參炔醇可直接或通過重塑巨噬細胞表型和功能間接影響乳腺癌細胞各項生物學行為。但人參炔醇在體內(nèi)是否能發(fā)揮相同作用以及具體機制有待進一步研究。