劉寶翠，鄭婷婷，董利陽(yáng)，牟笑，許鋮鋮，毛朝明

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

橋本甲狀腺炎（Hashimoto′s thyroiditis，HT）是一種常見(jiàn)的器官特異性自身免疫性疾?。?］，是引發(fā)甲狀腺功能減退最常見(jiàn)的病因，甲狀腺濾泡組織結(jié)構(gòu)的破壞和大量淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)是其主要病理基礎(chǔ)［2-3］。小窩蛋白-1（Caveolin-1）是小窩的標(biāo)志蛋白和主要蛋白成分［4］，與自身免疫性疾病的發(fā)生有一定相關(guān)性［5］。我們前期研究表明Caveolin-1在橋本甲狀腺炎的甲狀腺組織中呈現(xiàn)低表達(dá)［6］，提示Caveolin-1參與橋本甲狀腺炎的發(fā)病。本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染方式敲減甲狀腺上皮細(xì)胞Nthy-ori 3-1中的Caveolin-1基因，旨在探索Caveolin-1表達(dá)降低對(duì)甲狀腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的影響，初步揭示Caveolin-1低表達(dá)對(duì)甲狀腺上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺上皮細(xì)胞株Nthy-ori 3-1（歐洲標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞收藏中心，ECACC）；人胚腎上皮細(xì)胞293T（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；兔抗β-肌動(dòng)蛋白抗體、兔抗Caveolin-1抗體（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；牛血清白蛋白（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；總RNA提取試劑盒RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；2×含染料Taq預(yù)混PCR反應(yīng)試劑（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）；Caveolin-1 shRNA引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑LipoFiterTM（漢恒生物科技上海有限公司）；嘌呤霉素、聚凝胺（Sigma公司）；慢病毒包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2、shRNA慢病毒表達(dá)載體pLKO.1-嘌呤霉素（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；ECL發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒、PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）；MTT、活性氧檢測(cè)試劑盒（南通碧云天生物公司）；AnnexinV Alexa Fluor 647/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（南京福麥斯生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1細(xì)胞、293T細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基中，并于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒包裝及感染 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前1天將293T細(xì)胞接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度為60%時(shí)，將目的基因質(zhì)粒sh Caveolin-1或空載pLKO.1與包膜質(zhì)粒 pMD2.G、包裝質(zhì)粒 psPAX2用 LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中（目的質(zhì)?；蚩蛰d∶pMD2.G∶psPAX2=4∶1∶3）。收集48 h的病毒液，加入提前接種在6孔板中的Nthy-ori3-1細(xì)胞中，同時(shí)加入聚凝胺以提高病毒感染細(xì)胞的效率。6～8 h后棄病毒液換成完全培養(yǎng)基，48 h后用5 mg·L-1嘌呤霉素2～3 d篩選出所需細(xì)胞，獲得sh-NC（空載質(zhì)粒病毒感染）細(xì)胞和sh Caveolin-1（目的基因質(zhì)粒病毒感染）細(xì)胞。空白對(duì)照組Nthy-ori 3-1細(xì)胞不做任何處理。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)Caveolin-1 mRNA表達(dá) 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-ori 3-1細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA。在37℃1 h、85℃15 s、4℃保存反應(yīng)條件下，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBRGreen法進(jìn)行 qRT-PCR。Caveolin-1上游：5′-TCAACCGCGACCCTAAACACC-3′，下游：5′-TGAAATAGCTCAGAAGAGACA-3′；GAPDH上游：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游：5′-GGGTGGAATCATATTGGAACA-3′。反應(yīng)條件為正常兩步法，50℃2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參，所得結(jié)果用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Caveolin-1蛋白表達(dá) 收集用0.25%胰酶消化后的各組Nthy-ori 3-1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000×g離心3 min后，吸取蛋白上清液，加入5×上樣緩沖液，混勻后100℃煮10 min后，每孔加5μg蛋白，10%SDS-PAGE分離膠進(jìn)行蛋白電泳。60 mA恒流電泳至溴酚藍(lán)剛好跑出，低溫恒壓轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜，TBST洗膜（10 min×3次），用含HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗（1∶5 000）在37℃孵育1 h后，TBST洗膜（10 min×3次）后，ECL顯影。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 MTT法檢測(cè)Nthy-ori3-1細(xì)胞增殖 將各組Nthy-ori3-1細(xì)胞以3.5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h和48 h后，棄去上清液，每孔加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT培養(yǎng)基100μL，孵育4 h。棄去上清液，每孔加入100μL DMSO振蕩5～10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫分析儀（EXL800）測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔光密度（D）值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nthy-ori3-1細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用無(wú)EDTA的胰酶消化并收集，250×g離心5 min。用100μL緩存液懸浮細(xì)胞，加入5μL AnnexinV/Alexa Fluor 647和10μL的PI溶液，混勻室溫避光孵育15 min。孵育結(jié)束后，加400μL PBS混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.7 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)Nthy-ori 3-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 將各組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/孔加入6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入提前配制好的終濃度為10μmol·L-1的DCFH-DA探針，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。之后將細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，用不含胎牛血清的RPMI 1640重復(fù)洗滌3次。立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Caveolin-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染Nthy-ori 3-1細(xì)胞的干擾效果驗(yàn)證

Caveolin-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染Nthy-ori 3-1細(xì)胞后，qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細(xì)胞中 Caveolin-1的mRNA（t=21.70，P＜0.01）和蛋白水平（t=12.21，P＜0.01）明顯下調(diào)；而sh-NC組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異。這一結(jié)果提示Caveolin-1敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

圖1 Caveolin-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染Nthy-ori3-1細(xì)胞的干擾效果驗(yàn)證

2.2 Caveolin-1敲減后Nthy-ori 3-1細(xì)胞增殖能力下降

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組 24 h（n=5；t=16.00，P＜0.01）和48 h（n=5；t=23.12，P＜0.01）的細(xì)胞增殖率均明顯降低；而sh-NC組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。sh Caveolin-1組24 h和48 h間細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異，故Caveolin-1敲減后最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間選為24 h。

圖2 敲減Caveolin-1后Nthy-ori3-1細(xì)胞增殖率變化

2.3 Caveolin-1敲減后Nthy-ori3-1細(xì)胞凋亡增加

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細(xì)胞凋亡率明顯增加（n=3；t=12.09，P＜0.01）；而sh-NC組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖3。

2.4 Caveolin-1敲減后Nthy-ori 3-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高

用活性氧檢測(cè)探針DCFH-DA的平均熒光強(qiáng)度反映Nthy-ori 3-1細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯增加（n=3；t=16.835，P＜0.01）；而sh-NC組與空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 敲減Caveolin-1后Nthy-ori3-1細(xì)胞凋亡率變化

圖4 Caveolin-1敲減后Nthy-ori3-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化

橋本甲狀腺炎的發(fā)病率僅次于毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves?。?］，且患病率在我國(guó)以每年5%的速度升高。迄今為止，橋本甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，尚無(wú)針對(duì)病因的治療措施。Caveolin-1是一種細(xì)胞表面穴樣內(nèi)陷中的主要膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為22 kDa，富含糖鞘脂和膽固醇［8］，參與癌癥、糖尿病、心血管疾病、系統(tǒng)性硬化病、肺纖維化等多種疾病的發(fā)生［9-12］。Caveolin-1在橋本甲狀腺炎的甲狀腺組織中呈現(xiàn)低表達(dá)［6，13］，提示Caveolin-1參與橋本甲狀腺炎的發(fā)病，然而其作用機(jī)制仍未完全清楚。

Caveolin-1定位于人染色體7q31.1，在上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等一些終末細(xì)胞中含量豐富。Caveolin-1介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞、膽固醇平衡、代謝轉(zhuǎn)化，影響心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等的增殖和凋亡［14-15］。已有研究表明，在橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中，caspase-3、caspase-6等凋亡蛋白的水平明顯高于正常甲狀腺組織［16-17］。而Caveolin-1低表達(dá)是否與甲狀腺上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，目前并不清楚。我們的研究結(jié)果顯示Caveolin-1敲減后Nthyori3-1細(xì)胞的增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示Caveolin-1異常低表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞的凋亡來(lái)參與橋本甲狀腺炎的發(fā)病，表明Caveolin-1可能是橋本甲狀腺炎治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

活性氧是細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的正常代謝產(chǎn)物，主要是一些短暫存在的具有高度活性且分子量較小的含氧代謝物［18］。生理濃度的活性氧可以作為第二信使參與細(xì)胞多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)不同生物反應(yīng)如參與基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞死亡等一系列生理過(guò)程，在決定細(xì)胞命運(yùn)中起到極其重要的作用［19］。然而，過(guò)多活性氧的生成是引發(fā)炎癥反應(yīng)的一種重要機(jī)制，甚至可以引發(fā)組織系統(tǒng)持續(xù)性炎癥反應(yīng)［19-20］。在正常生理狀態(tài)下，甲狀腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生適量水平的活性氧參與甲狀腺激素的合成［21］，但是高水平活性氧的產(chǎn)生則可誘發(fā)氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞的損傷，引發(fā)甲狀腺炎癥促進(jìn)橋本甲狀腺炎的進(jìn)展［19，22］。更為重要的是Kolypetri等［23］和本課題組［16］的研究發(fā)現(xiàn)活性氧可以誘導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Caveolin-1敲減后Nthyori3-1細(xì)胞中活性氧的表達(dá)升高，提示Caveolin-1低表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)Nthy-ori 3-1細(xì)胞中活性氧的積累進(jìn)而導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞凋亡的增加。

綜上所述，體外Caveolin-1敲減后甲狀腺上皮細(xì)胞增殖能力明顯下降，凋亡和活性氧水平明顯增加，提示甲狀腺上皮細(xì)胞內(nèi)Caveolin-1異常降低可能是橋本甲狀腺炎發(fā)生、發(fā)展的重要原因，同時(shí)也提示Caveolin-1可能是橋本甲狀腺炎干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。