柯呈輝，何立江，黃俊杰，杜思明，林樹峰，白海濱，吳文華

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，福建 泉州 362000)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以低骨量為特征的疾病，導(dǎo)致骨質(zhì)惡化和骨骼強(qiáng)度受損。它被認(rèn)為是引起骨折的主要原因，在美國大約有1 000萬50歲以上成人受其影響[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，全球每年有166萬例髖部骨折發(fā)生，預(yù)計(jì)到2050年該數(shù)字將增加4倍[2]。雖然絕經(jīng)后女性服用雙膦酸鹽類藥物(bisphosphonate drugs，BPs)后典型骨折的發(fā)生率有所下降，但非典型骨折的發(fā)生率在過去十年中卻有所增加[3]。而BPs類藥物治療被認(rèn)為是預(yù)防和治療OP的第一線，并且已在多項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)(randomized controlled trial，RCTs)[4-7])中被證明可降低典型髖部骨折的發(fā)生率。BPs通過增加骨礦物質(zhì)密度和預(yù)防脆性骨折來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)[8-10]。然而，長期使用BPs有潛在的嚴(yán)重抑制骨轉(zhuǎn)換的風(fēng)險，這可能損害骨重塑的能力，最終導(dǎo)致微損傷的累積以及骨韌性的降低和脆性的增加[11-19]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M短期內(nèi)應(yīng)用BPs類藥物對于骨質(zhì)疏松性骨折(Osteoporotic l fracture，OPF)的愈合影響并進(jìn)行生物力學(xué)分析，探討B(tài)Ps類藥物與OPF愈合的相關(guān)性，為臨床OPF后短期應(yīng)用BPs類藥物提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1.1.1 動物 同時期健康6月齡雌性SD大鼠90只，所有動物均購自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動物貿(mào)易有限公司，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室內(nèi)分組籠養(yǎng)，室溫控制在(22±2)℃，8：00～20：00時自然光線照射，其余時間關(guān)燈。由專人喂養(yǎng)，自由飲水，并根據(jù)大鼠的生長速度調(diào)節(jié)飼料和飲用水的高度。所有飼料均購自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動物貿(mào)易有限公司。

1.2 試劑和器材 a)利塞膦酸鈉膠囊(江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇)。b)水合氯醛(CP滬試，≥99.0%，250 g，國藥試劑cas302-17-0；上海)。c)克氏針若干，規(guī)格為直徑1.5 mm。d)DR數(shù)字化攝影機(jī)(德國，飛利浦公司)。e)骨組織標(biāo)本制作裝置：切片機(jī)、載玻片、石蠟等(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)。f)雙能X線吸收儀(美國，HOLOGIC公司)。g)常規(guī)動物手術(shù)器械(中國人民解放軍第180醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室)。h)Endura TEC ELF 3200力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器及其配套的Wintest生物力學(xué)測試軟件(Bose公司，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)前稱重和攝片 每只大鼠每周稱重并記錄。實(shí)驗(yàn)時間為每天晚上6點(diǎn)到8點(diǎn)。時間為期1.5個月。所有大鼠均在10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射下麻醉。麻醉后拍攝大鼠俯臥位片，將頭部和身體擺正后攝片。

1.4 動物分組及模型制作

1.4.1 動物分組 所有大鼠均獨(dú)立隨機(jī)分配在動物實(shí)驗(yàn)箱里，箱子表面標(biāo)記A1-A30、B1-B30、C1-C30，每天專人給予飼料喂養(yǎng)，自由飲水，采用相同的照明，并根據(jù)大鼠的生長速度調(diào)節(jié)飼料和飲用水的高度。

1.4.2 大鼠骨質(zhì)疏松模型建立 a)A組：10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，選用背側(cè)入路，取脊柱旁開1 cm、髂骨脊上2 cm處為手術(shù)切口，縱行切開約1 cm，切開皮膚和皮下組織，分離肌層，暴露雙側(cè)卵巢。后逐層關(guān)閉切口。嚴(yán)格無菌手術(shù)操作，術(shù)后連續(xù)3d予肌注青霉素80萬單位，2次/d。術(shù)后籠中自由活動與進(jìn)食。b)B、C組：10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，選用背側(cè)入路，取脊柱旁開1 cm、髂骨脊上2 cm處為手術(shù)切口，縱行切開約1 cm，切開皮膚和皮下組織，分離肌層，顯露腹腔內(nèi)雙側(cè)卵巢，分別切除卵巢后殘端結(jié)扎，逐層關(guān)閉切口。嚴(yán)格無菌手術(shù)操作，術(shù)后連續(xù)3 d予肌注青霉素80萬單位，2次/d。術(shù)后籠中自由活動與進(jìn)食。c)BMD值檢測：卵巢切除術(shù)后4周，在10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，檢測各組大鼠右側(cè)股骨中段BMD值，各組大鼠前后前后BMD均值對比，結(jié)果出現(xiàn)明顯差異提示骨質(zhì)疏松模型建模成功。本實(shí)驗(yàn)術(shù)后檢測中，未見大鼠死亡現(xiàn)象，各組大鼠BMD值測量結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明骨質(zhì)疏松模型造模成功，成功率為100%。d)股骨生物力學(xué)性能檢測：處死大鼠制作右側(cè)股骨病理標(biāo)本，采用En-dura TEC ELF 3200力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行4點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。頂端跨距為8 mm，底端跨距為20 mm，加載速度為1 mm/min。測量時保持各標(biāo)本位置一致，并保持標(biāo)本濕潤狀態(tài)。通過載荷-位移曲線獲得最大載荷；以骨折側(cè)股骨最大載荷占對側(cè)非骨折側(cè)股骨最大載荷比例表示骨折載荷恢復(fù)率。

1.4.3 OP大鼠骨折模型的制作 a)A組：10%水合氯酸(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，選取右側(cè)股骨中段為手術(shù)切口，縱行切開約1 cm，切開皮膚和皮下組織，分離肌層顯露股骨，逐層縫合各層組織。嚴(yán)格無菌手術(shù)操作，術(shù)后連續(xù)3 d予肌注青霉素80萬單位，2次/d。b)B、C組：10%水合氯酸(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，選取右側(cè)股骨中段為手術(shù)切口，縱行切開約1 cm，切開皮膚和皮下組織，分離肌層顯露股骨中段，線鋸于股骨中段，并橫行鋸斷股骨，選用直徑1.5 mm克氏針經(jīng)髓腔固定骨折斷端，逐層縫合各層組織。嚴(yán)格無菌手術(shù)操作，術(shù)后連續(xù)3 d予肌注青霉素80萬單位，2次/d。c)給藥途徑與劑量：B組于骨折術(shù)后3 d開始每天給予0.1 mg/kg·d，利塞膦酸鈉灌胃治療；A、C組給予同等劑量0.9%生理鹽水灌胃。d)術(shù)后第3、6周：各組大鼠在術(shù)后第3、6周隨機(jī)抽取大鼠10只，處死并去除骨折內(nèi)固定物，制作右側(cè)股骨病理標(biāo)本，檢測右側(cè)股骨骨痂處BMD值，并進(jìn)行生物力學(xué)檢測。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各檢測數(shù)值結(jié)果 在各組大鼠骨折建模過程中，BMD值進(jìn)行組間、組內(nèi)對比情況，建模前各組大鼠組間對比，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，建模后3周與建模前、建模后6周與建模前各組間、組內(nèi)比較，均P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明利塞膦酸鈉可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中BMD升高。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠骨質(zhì)疏松性骨折建模前后BMD值比較

在各組大鼠骨質(zhì)疏松性骨折建模前后生物力學(xué)性能組間、組內(nèi)對比情況中，均P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除了在最大載荷恢復(fù)率中，B、C組間對比，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在最大載荷中，C組組內(nèi)對比，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明利塞膦酸鈉可增強(qiáng)新生骨痂結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和力學(xué)強(qiáng)度。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠骨質(zhì)疏松性骨折建模前后生物力學(xué)性能比較

3 討 論

OP是一種骨礦基代謝疾病，其特點(diǎn)主要為骨密度下降、骨礦物質(zhì)削減，骨小梁稀松，進(jìn)而致使骨機(jī)械強(qiáng)度下降、脆性增高，容易導(dǎo)致病理性骨折。OPF是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，多發(fā)于老年人，發(fā)生率較高，因OP的特征故而導(dǎo)致OPF多呈粉碎型，愈合慢。且因骨強(qiáng)度低和骨脆性高而容易引起內(nèi)固定松動和再骨折發(fā)生，故而殘疾率和死亡率相對較高[20]。就目前的研究現(xiàn)狀來說，BPs類藥物成為臨床防治OPF最常用的一線藥物，其治療目標(biāo)是防止進(jìn)一步的骨質(zhì)流失，以減少初始或后續(xù)骨折的風(fēng)險，故該類藥物的應(yīng)用顯著降低OPF的發(fā)生：有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用BPs后脊柱骨折發(fā)生率降低了40%～70%，髖部骨折發(fā)生率降低了40%～50%[21]。然而，考慮到BPs類藥物的主要作用機(jī)制，基于抑制破骨細(xì)胞活性和隨后抑制骨形成[22]，人們擔(dān)心它們長期應(yīng)用是否會延遲或損害骨折愈合的能力[22-26]，甚至引起新發(fā)骨折形成。

本實(shí)驗(yàn)就是基于這個思考而設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)主要探尋在OPF中，短期使用利塞膦酸鈉對于OPF愈合的影響，進(jìn)而推測長期應(yīng)用BPs類藥物引起新發(fā)骨折的可能原因。為臨床短期內(nèi)應(yīng)用BPs類藥物提供一定的依據(jù)。因?yàn)槟壳坝邢嚓P(guān)研究表明，有相當(dāng)一部分患者在發(fā)生嚴(yán)重骨質(zhì)疏松性骨折后才接受了抗骨質(zhì)疏松藥物治療。例如，Klop等[27]報(bào)道在英國人數(shù)將近達(dá)到了一半(45.5%)。Gillespie等[28]則指出，在美國有17.1%的女性在第一次髖部骨折后才接受了骨質(zhì)疏松評估和治療。而根據(jù)對日本患者的調(diào)查，Hagino等[29]最近證實(shí)，大多數(shù)髖部脆性骨折的患者沒有接受預(yù)防第二次骨折的藥物治療。Iba等人[30]對730個骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行調(diào)查，612例(83.8%)患者未接受任何抗骨質(zhì)疏松癥藥物治療，僅有118例(16.2%)患者出院后接受骨質(zhì)疏松癥藥物治療。所以探討患者發(fā)生OPF后，立即短期使用BPs類藥物對于骨折愈合的影響具有顯著的臨床意義。

在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠發(fā)生OPF后，短期內(nèi)使用利塞膦酸鈉可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中骨折處BMD升高，增強(qiáng)骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和力學(xué)強(qiáng)度。這一點(diǎn)可以從BPs類藥物的藥效動力學(xué)方面解釋：BPs類藥物對骨骼有雙重作用。第一種是通過減少由于預(yù)防破骨細(xì)胞生成和促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡而破壞破骨細(xì)胞的數(shù)量來阻止骨質(zhì)流失[31-32]，第二種是在各種病理?xiàng)l件下抑制骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡[33-34]。利塞膦酸鈉作為第三代BPs類藥物，主要是通過抑制促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成、分化成熟及凋亡過程的焦磷酸法尼酯合酶(FPPS)形成來起作用的，進(jìn)而相對的促進(jìn)骨形成過程，促進(jìn)骨礦化。且利塞膦酸鈉具有在骨折處蓄積效應(yīng)。因?yàn)槭聦?shí)上，BPs類藥物從骨骼中消除的半衰期長達(dá)10年[35]。通過觀察，停止BPs類藥物治療8年后患者尿液中仍可檢測到帕米膦酸納水平[36]。故在本實(shí)驗(yàn)檢測的BMD結(jié)果中，我們不難發(fā)現(xiàn)BMD的變化趨勢存在一定程度上的時間依賴性，即隨著時間的進(jìn)展增加速度增快。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，骨折處BMD明顯升高情況下，骨痂的生物力學(xué)存在如下特性：在短期使用利塞膦酸鈉情況下，最大載荷和最大載荷恢復(fù)率明顯升高，且在一定程度上存在時間依賴性。3組大鼠在組間或組內(nèi)對比中，骨痂的最大載荷、最大載荷恢復(fù)率均隨時間的延長逐漸減少，但在B組中各時間點(diǎn)的最大載荷均高于同期C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明可能在髓內(nèi)釘固定和使用利塞膦酸鈉后，骨折斷端存在的微動和利塞膦酸鈉均能促進(jìn)骨痂的礦化，使得最初在骨折端形成的體積較大的纖維骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)化，骨重塑階段最先開始，骨痂的體積逐漸變小，力學(xué)性能也不斷提高。而且一定程度的力學(xué)刺激也可以促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在礦化骨痂形成以后，新生骨痂即進(jìn)入重塑階段。在這個階段，主要是機(jī)械應(yīng)力的變化影響骨的形成。而且Sigurdsen等學(xué)者[37]在觀察大鼠脛骨骨折模型過程中，發(fā)現(xiàn)軸向壓縮與軸向拉伸相比，其更能促進(jìn)骨的礦化程度、機(jī)械強(qiáng)度及剛度上升。

本研究僅觀察了OPF后6周內(nèi)使用利塞膦酸鈉對于骨折愈合情況的影響，所研究時間跨度不長。目前臨床上對于OPF患者是否短期內(nèi)應(yīng)用BPs類藥物促進(jìn)骨折愈合仍不明確，這也是本實(shí)驗(yàn)探究OPF患者短期內(nèi)應(yīng)用利塞膦酸鈉的必要性。本實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)的研究時間跨度，進(jìn)一步了解時間因素對于骨折愈合情況的影響。且本實(shí)驗(yàn)在探究BPs類藥物的用藥劑量、用藥頻率、用藥方式等方面存在局限性，這幾方面也是可能影響骨折愈合的危險因素。本實(shí)驗(yàn)中，樣本量較小，其結(jié)果的穩(wěn)定性可能不足，同時還應(yīng)該對于骨痂進(jìn)行病理切片，進(jìn)一步了解骨痂的組織構(gòu)成及成分。