楊 鳴 楊文臣

作者單位：黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)三科 161000

腦血管相關(guān)疾病是神經(jīng)內(nèi)科常見的腦血液循環(huán)障礙性疾病，發(fā)病率和致死率呈逐年增高的趨勢[1]。目前，腦血管相關(guān)疾病已成為威害中老年人健康的首要疾病[2]。腦出血(ICH)是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，是腦血管疾病中最兇險的疾病之一，致死率遠高于缺血性腦血管病[3]。腦出血的死亡率在3個月內(nèi)高達20%左右，即使患者幸存下來，他們大多伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損和認知功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[4,5]。目前，雖然腦出血的病理機制尚不清楚，但大多數(shù)學(xué)者認為，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在血腦屏障破壞、腦水腫、氧化應(yīng)激等中發(fā)揮重要作用。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要免疫細胞，也是腦組織的常駐守衛(wèi)細胞[6,7]。當(dāng)發(fā)生腦出血時，血液中的免疫物質(zhì)進入腦組織形成炎性反應(yīng)并激活小膠質(zhì)細胞[8]。小膠質(zhì)細胞激活能夠分泌大量的趨化因子、炎癥因子、蛋白酶以及其他細胞毒性產(chǎn)物，增加循環(huán)血液中的炎性細胞聚集，放大炎癥反應(yīng)而加重神經(jīng)細胞損傷[9]。因此，小膠質(zhì)細胞在腦出血的進程中起著關(guān)鍵作用。本研究探討白藜蘆醇(RES)對小膠質(zhì)細胞和腦出血的作用，為臨床治療腦出血提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實驗動物和藥物處理 購買90只SD大鼠(北京維通利華生物有限公司，中國)，適應(yīng)環(huán)境1周后將SD大鼠隨機分為對照組、腦出血模型組和腦出血模型+白藜蘆醇組，每組30只，采用Rosenberg法進行大鼠腦出血模型的構(gòu)建。腦出血模型組SD大鼠按照300mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛。麻醉后，剝離大鼠骨膜，取大鼠自體不凝血80μl，慢慢注入左側(cè)大鼠尾狀核部位，并縫合切口部位。對照組SD大鼠不注血，其余步驟同上；腦出血模型+白藜蘆醇組，給予白藜蘆醇(30mg/kg)，其余步驟同上。48h后取三組大鼠腦組織進行后續(xù)研究。

1.2 神經(jīng)功能評分 根據(jù)Clark評分法，評價三組大鼠神經(jīng)功能受損情況，主要包括身體對稱性、步態(tài)、攀爬、轉(zhuǎn)圈試驗、前肢對稱性，每項評分范圍為(0～4)分，共(0～20)分，神經(jīng)功能障礙越重時評分越高。

1.3 腦組織含水量測定 記錄大鼠體重后，按照300mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛，用200ml生理鹽水和4%多聚甲醛(索萊寶，中國)將大鼠腦組織灌注固定，取出腦組織，分離左右大腦半球，用電子天平立即稱取腦組織重量，即濕質(zhì)量；然后將腦組織放入100℃電烤箱中，24h后稱取腦組織重量，即干質(zhì)量。計算腦含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.4 腦組織血腫體積評估 采用冰凍切片檢測腦組織血腫體積。將大鼠腦組織灌注固定后，用冰凍切片機以100μm的厚度進行連續(xù)切片。用相機拍攝，并用Image-Pro Plus分析每張切片的血腫面積。計算血腫體積=每張切片血腫面積×0.1mm×層數(shù)。

1.5 大鼠小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 將SD乳鼠浸泡于75%乙醇中，用眼科彎剪剪去乳鼠頭部取腦，并將置于含有10%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液(Corning，美國)中。剝?nèi)ツX部表面的血管和腦膜，并用直剪和彎鑷將腦組織剪成碎片，并將腦組織碎片在4℃條件下，1000r/min，離心10min。離心后棄凈上清，在37℃條件下，用胰酶(碧云天，中國)消化30min。此外，加入Dnase(Thermo，美國)后用吸管反復(fù)吹打混勻。靜置10min后，4℃條件下，1000r/min，離心10min。并將細胞接種于多聚賴氨酸涂布后的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)1周后，向細胞培養(yǎng)瓶中加入Dnase，置于搖床上旋轉(zhuǎn)，使小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分離，將上清置于離心機中，1000r/min，離心10min，此時獲得小膠質(zhì)細胞，分組為對照組和白藜蘆醇組，進行后續(xù)實驗。

1.6 CCK-8實驗 將小膠質(zhì)細胞接種于96孔板中，次日給予濃度為25μM的白藜蘆醇處理，24h后應(yīng)用CCK-8試劑盒(同仁，日本)，在450nm波長處檢測細胞活性。

1.7 ELISA檢測 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(Proteintech，美國)說明書，檢測大鼠腦組織血腫周圍和細胞中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表達。

2.結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對腦出血大鼠神經(jīng)功能評分的影響 與對照組相比，腦出血模型組神經(jīng)功能評分顯著升高，而腦出血模型+白藜蘆醇組神經(jīng)功能評分顯著低于腦出血模型組，但高于對照組(圖1)。

圖1 三組大鼠神經(jīng)功能評分比較

2.2 白藜蘆醇對腦出血大鼠腦組織含水量的影響 與對照組相比，腦出血模型組腦組織含水量顯著升高，而腦出血模型+白藜蘆醇組腦組織含水量顯著低于腦出血模型組，但高于對照組(圖2)。

圖2 三組大鼠腦組織含水量比較

2.3 白藜蘆醇對腦出血大鼠腦組織血腫體積的影響 與對照組相比，腦出血模型組腦組織血腫體積顯著增加，而腦出血模型+白藜蘆醇組腦組織血腫體積顯著低于腦出血模型組，但高于對照組(圖3)。

圖3 三組大鼠腦組織血腫體積比較

2.4 白藜蘆醇對腦出血大鼠腦組織血腫周圍炎性因子的影響 與對照組相比，腦出血模型組腦組織血腫周圍炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表達顯著升高；與模型組相比，腦出血模型+白藜蘆醇組組織血腫周圍炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表達顯著降低(圖4A～4D)。

圖4 三組大鼠腦組織血腫周圍炎性因子水平比較

2.5 白藜蘆醇對小膠質(zhì)細胞活性的影響 與對照組小膠質(zhì)細胞相比，給予白藜蘆醇后小膠質(zhì)細胞活性無變化(圖5)。

圖5 兩組細胞活性比較

2.6 白藜蘆醇對小膠質(zhì)細胞炎性因子的影響 與對照組小膠質(zhì)細胞相比，給予白藜蘆醇后小膠質(zhì)細胞炎性因子顯著降低(圖6A～6D)。

圖6 兩組細胞炎性因子水平比較

3.結(jié)論

腦出血后血腫周圍腦組織內(nèi)發(fā)生一系列的繼發(fā)性腦損傷，正常神經(jīng)元可能變成凋亡神經(jīng)元或發(fā)生壞死，進而引起神經(jīng)功能障礙[10,11]。大多數(shù)研究認為炎癥反應(yīng)使腦出血后引起繼發(fā)性腦損傷的主要原因[12,13]。目前，腦出血的治療僅限于血壓控制、顱內(nèi)壓治療和血腫清除術(shù)，并不能盡快控制腦出血后炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性腦損傷[14,15]。因此，尋找一個有效治療腦出血后炎癥反應(yīng)或繼發(fā)性腦損傷的藥物尤為重要。

本研究中，神經(jīng)功能評分、腦組織含水量評測定、腦組織血腫體積評估結(jié)果表明，給予白藜蘆醇能夠減輕腦出血模型組大鼠神經(jīng)功能損傷，降低腦組織含水量，抑制腦組織血腫體積的增加，有效改善腦出血后的腦損傷。ELISA實驗結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠降低腦出血模型組大鼠腦組織血腫周圍炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的水平，這些炎性因子的表達是炎癥反應(yīng)的主要標(biāo)志，表達水平的降低說明白藜蘆醇能夠抑制腦出血后腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)報道，腦部的炎性反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細胞分泌和釋放[16]。因此，我們繼續(xù)檢測白藜蘆醇對小膠質(zhì)細胞活性和炎性因子表達的影響。CCK-8結(jié)果表明，白藜蘆醇并不影響小膠質(zhì)細胞活性。ELISA實驗結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠顯著降低小膠質(zhì)細胞炎性因子表達水平。因此，我們認為白藜蘆醇可能通過抑制小膠質(zhì)細胞炎性因子表達，抑制腦出血后炎癥的發(fā)生，進而改善腦出血后繼發(fā)性腦損傷。

綜上所述，白藜蘆醇可能抑制小膠質(zhì)細胞分泌和釋放炎性因子，抑制腦內(nèi)炎癥的發(fā)生，進而對腦部具有保護作用。