閆苗 羅青 賴春芬

摘要：錳過氧化物酶（MnP）是降解木質(zhì)素等各種芳香類化合物的關(guān)鍵酶之一，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價值。優(yōu)化了杏鮑菇菌糠錳過氧化物酶的提取條件，利用硫酸銨分級沉淀、雙水相萃取、透析濃縮和冷凍干燥的方法獲得一定純度的成品酶。結(jié)果表明：粉碎時間30 s，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min，搖床時間1 h，提取溫度30 ℃，水作為提取液并且料液比 1 g∶ 5 mL 的優(yōu)化工藝下，經(jīng)20%硫酸銨分級沉淀、雙水相萃取、透析濃縮和冷凍干燥后獲錳過氧化物酶3.075 U/g，回收率79.33%，說明杏鮑菇菌糠中錳過氧化物酶含量高，具有重要應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇;菌糠;錳過氧化物酶（MnP）;純化

中圖分類號： TS255.36 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0297-05

目前，杏鮑菇已是市面上大量銷售的食用菌之一，由此而來的菌糠處理問題也愈加嚴(yán)峻?，F(xiàn)在，少數(shù)企業(yè)在工廠化生產(chǎn)杏鮑菇后將杏鮑菇菌糠就地燃燒，造成極大浪費的同時也污染了環(huán)境。盡管有學(xué)者對杏鮑菇菌糠進(jìn)行了研究，如覆土栽培、制成飼料、雙孢蘑菇栽培試驗等處理，但杏鮑菇菌糠處理方式依然甚少，高效且生態(tài)的方式更少[1-5]。杏鮑菇能產(chǎn)生3種存在于白腐菌中的木質(zhì)素酶，它們是漆酶、錳過氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過氧化物酶[6-8]。杏鮑菇菌糠中殘留了大量各種有利用價值的酶類[9-10]，MnP就是其中的一種。MnP能氧化一些很難被自然界氧化的木質(zhì)素類化合物，在有機污染物的降解、紙漿漂白、染料脫色、褐煤的生物降解、處理農(nóng)業(yè)廢棄物、聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)催化方面有較好的應(yīng)用前景[11-14]。目前，MnP工業(yè)化生產(chǎn)的方式有：通過改良產(chǎn)MnP菌株，篩選高產(chǎn)菌株，誘變選育來應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn);利用克隆MnP基因、基因工程、細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用于實際生產(chǎn)[15-21]?，F(xiàn)如今研究生產(chǎn)MnP的方式和方法還主要停留在實驗室提取少量MnP作為研究材料，來研究MnP工廠化生產(chǎn)的適宜條件。因此需要高效便捷的提取方法以及工藝以滿足工廠化大量生產(chǎn)MnP?；诖耍驹囼炌ㄟ^從杏鮑菇菌糠中提取分離MnP，優(yōu)化浸提條件，通過硫酸銨分級沉淀、雙水相萃取、透析濃縮冷凍干燥等進(jìn)一步純化MnP，這種方法不僅有效地利用了價格低廉的杏鮑菇菌糠，避免了杏鮑菇菌糠對環(huán)境的二次污染，而且高效地得到了工業(yè)利用價值極高的MnP，具有極高的工業(yè)化應(yīng)用前景，開拓新的MnP發(fā)展市場。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特色食用菌品種創(chuàng)新與代謝工程團隊于2015年10月下旬取自福建省正茸農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，選取顏色為灰黃色、硬度適中的杏鮑菇菌糠作為試驗材料，并于福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院105、107實驗室進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2 主要儀器

試驗所用主要儀器型號及生產(chǎn)廠家見表1。

1.3 方法

1.3.1 MnP粗酶液制備及蛋白質(zhì)測定 粗酶液制備：取菌區(qū)中間部位并粉碎，取10 g，按照栽培料 ∶ 水=1 g ∶ 10 mL比例加入蒸餾水，130 r/min，25 ℃搖床培養(yǎng)1 h;8層紗布過濾混合液，10 000 r/min，25 ℃離心20 min，上清即MnP粗酶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。

準(zhǔn)確移取0.7 mL 4 mmol/L的愈創(chuàng)木酚、2 mL 100 mmol/L pH值為4.5的琥珀酸鈉緩沖液、0.1 mL 2.5 mmol/L 的H2O2、0.2 mL 5 mmol/L的MnSO4 ，混合，搖勻，在40 ℃恒溫水浴鍋中水浴預(yù)熱5 min。將上述混合試劑倒入容積為3 mL的比色皿中，465 nm處調(diào)零。加入0.2 mL粗酶液，立即記錄吸光度，每隔30 s記錄1次，共記錄3 min。酶活單位定義為：每分鐘吸光度變化0.01所需酶量為1個酶活力單位（U）。酶比活定義為：酶活力占總蛋白的量。

1.3.2 提取條件優(yōu)化

1.3.2.1 粉碎時間及方式優(yōu)化 手碎、粉碎機分別粉碎栽培料10、20、30、60、90 s，按照上述MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定，計算最優(yōu)條件。

1.3.2.2 混合度優(yōu)化 搖床中的轉(zhuǎn)速分別為110、130、150 r/min，按照“1.3.1”節(jié)的MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定，獲得最優(yōu)條件。

1.3.2.3 混合時間優(yōu)化 搖床中的混合時間分別為0.5、1、1.5、2 h，按照“1.3.1”節(jié)的MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定，計算最優(yōu)條件。

1.3.2.4 提取溫度優(yōu)化 搖床中的提取溫度分別為20、25、30、35 ℃，按照“1.3.1”節(jié)的MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定數(shù)據(jù)，計算最優(yōu)條件。

1.3.2.5 提取液優(yōu)化 提取液分別為純凈水、0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.1 mol/L的丙二酸-丙二酸鈉緩沖液、0.1 mol/L的乳酸-乳酸鈉緩沖液、0.1 mol/L的曲拉通 x-100 緩沖液、0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，按照上述MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定各個提取液，計算最優(yōu)條件。

1.3.2.6 料液比優(yōu)化 按照栽培料 ∶ 水=1 g ∶ （4～15） mL比例加入蒸餾水40～150 mL，按照“1.3.1”節(jié)的MnP粗酶液制備以及蛋白測定步驟測定各個料液比下的數(shù)據(jù)，計算最優(yōu)條件。

1.3.3 純化條件優(yōu)化

1.3.3.1 硫酸銨分級沉淀 根據(jù)以上各個條件的優(yōu)化結(jié)果，最優(yōu)條件下制備得到的粗酶液，依據(jù)25 ℃飽和硫酸銨濃度調(diào)節(jié)表，制成含20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%硫酸銨的粗酶液;25 ℃下?lián)u床，130 r/min，7 h;25 ℃，10 000 r/min，10 min，離心3次。RO水溶解離心沉淀物質(zhì)，吸取0.01 mL作為3 mL體系內(nèi)的酶液。按照上述蛋白測定步驟測定各個離心管中上清液和沉淀數(shù)據(jù)，計算最佳硫酸銨分級沉淀數(shù)值。

1.3.3.2 雙水相體系優(yōu)化 參照雙水相萃取方法，進(jìn)行單因素試驗。MnP粗酶1 g，10%的硫酸銨，設(shè)PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000濃度梯度均為10%、15%、20%、25%、30%、35%，加蒸餾水至總體系9 g，確定最佳聚乙二醇（PEG）種類以及濃度;再利用最佳的PEG種類以及濃度，硫酸銨濃度梯度設(shè)為5%、10%、15%、20%、25%，加蒸餾水至總體系9 g，確定最佳硫酸銨濃度;以最佳的硫酸銨濃度、PEG種類以及濃度，設(shè)NaCl濃度為0%、2%、4%、6%、8%，加蒸餾水至總體系9 g，確定最佳的NaCl濃度;最后結(jié)合對比數(shù)據(jù)，確定最佳的雙水相體系。

1.3.3.3 透析除鹽 取一定量的60%硫酸銨酶液沉淀溶解液按照透析方法除鹽，每隔1 h換1次超純水。12 h后透析結(jié)束。透析效果檢查：用1% BaCl2檢查（NH4）2SO4，如有白色沉淀，則繼續(xù)透析，反之則可用1% AgNO3檢查NaCl、KCl，直至透析液中無白色沉淀，然后將透析袋平整鋪開在PEG 4000上，放置在4 ℃冰箱中進(jìn)行反滲透檢驗。

1.3.3.4 冷凍干燥濃縮 將冷凍干燥后的固體加入5 mL超純水溶解，取其中的1 mL液體稀釋100倍，作為冷凍干燥后的酶液。選用最優(yōu)雙水相體系，冷凍干燥后的酶液1 g，加蒸餾水至總體系9 g，記錄上下相的體積。按照上述MnP粗酶液蛋白測定步驟，采用3 mL反應(yīng)體系（測定酶活力所用的反應(yīng)體系為3 mL，即所加的酶液及試劑量總共3 mL）來測定冷凍干燥后的酶液、雙水相最優(yōu)體系上下相酶液以及濃縮液。

1.4 分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件LSD多重比較法進(jìn)行單因素方差分析，用Excel軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 MnP粗酶液蛋白測定

由牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得線性方程為 y=0.005 71x+0.117 54（r2=0.999 41），由吸光度數(shù)值計算得到MnP粗酶液的蛋白質(zhì)濃度為95.77 mg/mL，酶活為 9.577 U/mg。

2.2 提取條件優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1 粉碎方式及時間對MnP活性的影響 由圖1可知，用手捏碎杏鮑菇廢菌渣酶的回收活性最低，而用粉碎機粉碎 30 s 酶回收活性最高，為9.551 U/g，與其他處理方式及時間相比呈現(xiàn)顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）差異。隨著粉碎時間的增加，酶回收率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明粉碎機粉碎菌渣30 s時，菌渣的破壞程度最優(yōu)，此時MnP溶出量最大，而時間再增加時，菌渣破壞程度更大，破壞了酶的活性，導(dǎo)致酶回收率降低。

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對MnP活性影響 圖2顯示了最佳混合度，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min時，酶回收活性最高，為 10.561 U/g，與110、150 r/min混合度相比，呈現(xiàn)出顯著、極顯著差異。隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，整個酶活呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。在杏鮑菇菌糠中，存在大量有活性的菌絲體，轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力對菌體有破壞作用，從而抑制了MnP的合成和活性的表達(dá)。但轉(zhuǎn)速過低，又會導(dǎo)致?lián)u瓶內(nèi)溶解氧含量相對不足，也會抑制MnP的合成及活性。

2.2.3 混合時間對MnP活性影響 混合時間影響MnP的回收。由圖3可知，在混合時間條件優(yōu)化中，隨著時間增加，搖床混合時間1 h時酶回收活性最高，為12.321 U/g，與其他時間梯度相比有極顯著的差異，之后隨著時間增加，酶回收活性降低，這是由于混合時間太短，料液混合不充分，混合時間過長反而會使酶的活性降低。

2.2.4 溫度對MnP活性影響 溫度是影響酶活性的主要因素之一，在不同溫度梯度下，將菌液培養(yǎng)1 h后，測定MnP的活力。由圖4可知，30 ℃是酶的最佳回收溫度，酶活力達(dá) 11.079 U/g，與20、35 ℃處理呈現(xiàn)極顯著差異，但與25 ℃沒有顯著差異。一旦溫度達(dá)到35 ℃時，酶的回收活性急劇下降，這是因為溫度偏低或偏高均不利于酶的提取，溫度偏低會使酶的活性達(dá)不到最優(yōu)值，溫度過高會使酶失活，活性降低。

2.2.5 不同提取液對MnP活性影響 圖5顯示了不同提取液對酶回收活性的影響，對比之下，在不同的提取液中，純凈水（RO）作為提取液時酶的回收活性最高，與其他各組的提取液相比有極顯著差異，由此得出，水是最佳的提取液，其他提取液對酶的活性影響均比較大，均不適合作為酶的提取液。

2.2.6 料液比對MnP活性影響 由圖6可知，采用 1 g ∶ （4～15） mL 的料液比提取MnP，隨著料液比的增加，出現(xiàn)先增后減的變化趨勢，當(dāng)料液比為1 g ∶ 5 mL時，酶回收活性達(dá)到最大值，為11.562 U/g。在料液配比條件優(yōu)化中，料液比為1 g ∶ 5 mL時，與其他試驗組相比，呈現(xiàn)出顯著性及極顯著性差異，由此可知，水的配比越大，混合液在過濾時越容易流失MnP，不利于酶的提取。

2.3 純化條件優(yōu)化

2.3.1 硫酸銨分級沉淀結(jié)果及分析 上清液的酶活總量與沉淀的酶活總量之和是一個體系的酶活總量。從圖7中的折線走勢可以看出，隨著上清液的酶活總量降低而沉淀的酶活總量升高。在硫酸銨濃度為20%時，酶活總量最高，為 11.87 U，此時上清液酶活總量幾乎是整個酶體系的酶活總量，因此可以采用20%硫酸銨濃度進(jìn)行上清液的除雜;而硫酸銨濃度為60%時，其酶活總量出現(xiàn)第二高，為 11.67 U，此時沉淀酶活總量幾乎是整個酶體系的酶活總量，因此可以采用60%硫酸銨濃度進(jìn)行沉淀的提純。

2.3.2 雙水相體系優(yōu)化結(jié)果及分析 雙水相萃取廣泛應(yīng)用于粗酶提取與回收，生產(chǎn)一些純度較高的酶制劑，組成雙水相系統(tǒng)的水溶性高分子聚合物大多數(shù)富含羥基，對酶有保護作用，酶在雙水相系統(tǒng)中穩(wěn)定好，酶的活性較高，萃取過程可以在室溫下進(jìn)行等諸多優(yōu)點，在生物工程方面被廣泛應(yīng)用。圖8-a為不同PEG種類上、下相數(shù)據(jù)變化情況，不同種類的PEG，分子量大小、聚合度不盡相同。在PEG種類確定中，PEG 4000的作用效果較好，酶的回收活性也最優(yōu)，與PEG2000呈現(xiàn)極顯著差異，與PEG 6000呈極顯著差異，因此確定PEG為PEG 4000;圖8-b為不同PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取效果：根據(jù)顯著性差異分析，確定PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%;圖8-c為在最佳PEG種類及濃度下檢測不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取效果，根據(jù)差異性分析獲得，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時，與其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨呈現(xiàn)顯著或極顯著差異;圖8-d反映了在最佳PEG及硫酸銨質(zhì)量百分?jǐn)?shù)下，對比不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取效果，確定了NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。因此最終確定PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，酶1 g，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的雙水相體系為最優(yōu)雙水相萃取體系。

2.3.3 透析濃縮、冷凍干燥結(jié)果及分析 表2顯示了在不同純化條件下酶參數(shù)的變化，在最優(yōu)提取條件下得到的粗酶液酶活總量最高，且回收率為100%，但酶活力、總蛋白含量及酶比活均偏低。與粗酶液相比，經(jīng)硫酸銨沉淀后，酶活力、總蛋白含量最高，呈現(xiàn)極顯著差異。經(jīng)PEG 4000萃取之后，酶比活最高，與粗酶液相比呈現(xiàn)極顯著差異。透析濃縮、冷凍干燥后的酶比活是最優(yōu)化提取條件下得到的粗酶液酶比活的2倍，經(jīng)最佳硫酸銨分級沉淀，透析濃縮、冷凍干燥后可得到純化1.43倍的MnP酶固體。

3 小結(jié)與討論

MnP由真菌分泌，底物專一性比較弱，能有效分解芳香環(huán)類多聚體及一些難被生物降解的物質(zhì)，因此具有極高的工業(yè)應(yīng)用價值[11-14]。目前，從食用菌菌糠中提取MnP的工藝研究未見報道，從食用菌菌糠中提取MnP不僅擴大了獲得MnP的來源，更是對價格低廉的菌糠的高價值利用[6-9]。本試驗通過杏鮑菇菌糠MnP提取條件的優(yōu)化，獲得最佳的提取條件：粉碎機粉碎菌渣30 s時，菌渣的破環(huán)程度最優(yōu);混合時間為1 h時，混合最充分;料液比為1 g ∶ 5 mL最合適，水分過多，導(dǎo)致大量的酶在過濾時流失;提取溫度為30 ℃時是酶的最佳提取溫度，溫度過高或過低都會降低酶的活性;搖床的最佳轉(zhuǎn)速為130 r/min，轉(zhuǎn)速過高會對酶造成損傷，過低料液混合不充分;RO水作為提取液提取MnP為最優(yōu);經(jīng)硫酸銨分級沉淀即20%硫酸銨先沉淀，之后補足至60%硫酸銨，酶活有顯著提高。最后經(jīng)過透析濃縮、冷凍干燥后得到純化1.43倍的MnP酶固體，之后固體溶解稀釋，選用硫酸銨濃度20%，PEG 4000濃度20%，NaCl 4%，酶1 g，加蒸餾水至總體系 9 g，這時純化倍數(shù)為1.93，酶比活最高，為3.336 U/mg。本研究透析濃縮、冷凍干燥后MnP酶活為3.075 U/g，每年產(chǎn)生的大量杏鮑菇菌糠可以用來提取MnP，而這些MnP用來降解農(nóng)作物秸稈，必定可以產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。

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