蔡燕麗 劉歡 王翀

摘要：對新疆石河子和吐魯番2個地區(qū)釀酒葡萄園可培養(yǎng)酵母菌的種類鑒定及分布進(jìn)行研究，旨在明確釀酒葡萄園主要酵母種類及分布規(guī)律，為酵母菌資源的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。對釀酒葡萄園果實表面和土壤進(jìn)行稀釋后平板劃線分離純化，挑取單菌落，并對菌落和細(xì)胞顯微特征進(jìn)行形態(tài)觀察。對分離獲得的酵母菌株進(jìn)行WL培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察，區(qū)分聚類，選取其代表菌株進(jìn)行糖發(fā)酵及碳源利用試驗，且對其26S rDNA D1/D2區(qū)序列測序鑒定并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從釀酒葡萄園土壤及果實表面中共分離獲得41株酵母菌株，其中在石河子地區(qū)分離獲得28株，經(jīng)鑒定屬于隱球酵母屬（Cryptococcus）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、棒孢酵母屬（Clavispora）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）、紅酵母屬（Rhodotorula）、假絲酵母屬（Candida）、Rhodosporidiobolus和Kazachstania等10屬13種，在吐魯番地區(qū)共分離獲得13株，經(jīng)鑒定屬于棒孢酵母屬（Clavispora）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、Kazachstania和Rhodosporidiobolus等6屬6種。結(jié)果表明，新疆釀酒葡萄園的酵母菌組成具有較為豐富的多樣性，其應(yīng)用價值值得進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：新疆釀酒葡萄;酵母菌;多樣性分析;26S rDNA

中圖分類號： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0282-05

釀酒葡萄首要用途就是用來釀造葡萄酒。2014年新疆葡萄種植面積占全國葡萄面積的19.4%，產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的18.5%，居全國首位，而且產(chǎn)量持續(xù)增長[1]。新疆因其有特殊的氣候和生境而適宜葡萄的種植。新疆釀酒葡萄的種植主要集中在吐魯番、石河子周邊地區(qū)。近年，國內(nèi)對于釀酒葡萄的研究主要集中于地域性生境對釀酒葡萄種植的影響[2]和微生物群落多樣性分析[3]，少有對釀酒葡萄園中酵母菌的研究。新疆日照充沛，光合效率高，糖分積累容易，為酵母菌提供了適宜的生長環(huán)境，同時新疆晝夜溫差大的自然條件為酵母菌適應(yīng)性進(jìn)化提供了驅(qū)動力[4]，因此新疆酵母菌多樣性具有特殊性。

本研究采樣地點主要集中在吐魯番和石河子地區(qū)，它們分別位于41°12′～43°40′N，87°1′″～91°55′E之間和43°26′～45°20′N，84°58′～86°24′E之間，屬于獨特的暖溫帶大陸性干旱荒漠氣候和典型的溫帶大陸性高原氣候。本研究以釀酒葡萄園采集的土壤和果實為原料，在適宜的培養(yǎng)條件下分離篩選其中的酵母菌菌株，并進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)分類和分子生物學(xué)鑒定，探明新疆釀酒葡萄主產(chǎn)區(qū)可培養(yǎng)酵母菌菌群組成和分布。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 2016年8月在吐魯番與石河子地區(qū)分別選取1個釀酒葡萄園，采集樣地屬于規(guī)?；劸破咸褕@，葡萄樹齡在3～5年。分別在2個釀酒葡萄園中采集土壤和果實樣品，土壤按“S”形5點取樣混合法取樣，采集好的土壤和果實樣品裝入滅菌信封，放入冰盒，帶回石河子大學(xué)實驗室，放入4 ℃冰箱中保存，用于酵母菌的分離鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基[5]

1.1.2.1 YPD液體培養(yǎng)基 酵母浸粉10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.1.2.2 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值為6.0。

1.1.2.3 WL瓊脂培養(yǎng) 酵母浸粉4 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀550 mg/L，氯化鉀425 mg/L，氯化鈣125 mg/L，硫酸鎂125 mg/L，氯化鐵2.5 mg/L，硫酸錳 2.5 mg/L，溴甲酚綠22 mg/L，瓊脂 20 g/L，pH值為5.5。

1.1.2.4 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基 6 g/L酵母粉，20 g/L 糖，8磅 15 min 滅菌。發(fā)酵用糖類包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖和棉子糖等。

1.1.2.5 碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （NH4）2SO4 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，酵母粉 0.2 g/L，碳源5 g/L，8磅15 min滅菌。同化試驗用碳源包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、纖維二糖、海藻糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖和可溶性淀粉等。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-100B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）;HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;FroFleX PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）;5424R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）;SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與保藏[5] 稱取5 g分離樣品，倒入裝有 50 mL 滅菌YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖培24～48 h。然后在超凈工作臺上按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離。移取稀釋液0.1 mL涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取單菌落在PDA固體培養(yǎng)基上近一步劃線純化2～3次，獲得純培養(yǎng)物。純化菌株采用PDA斜面和干粉冷凍保藏[6-7]。

1.3.2 酵母菌形態(tài)聚類分析 根據(jù)酵母菌分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法，對菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和細(xì)胞顯微形態(tài)分析[5]。同時將單菌落劃線于WL鑒別培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d[8]。依據(jù)菌落特征和細(xì)胞顏色等不同對分離菌株進(jìn)行初步歸類。菌落特征包括菌落形態(tài)、色澤、濕潤程度、表面是否光滑、邊緣是否整齊等。細(xì)胞顯微形態(tài)包括細(xì)胞形狀、大小、繁殖方式、是否有假菌絲等。

1.3.3 酵母菌生理生化指標(biāo) 對分離獲得的菌株進(jìn)行生理生化鑒定[5，9]。

1.3.4 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 將獲得的酵母細(xì)胞接種在5 mL YPD液體培養(yǎng)基中 28 ℃ 培養(yǎng)過夜，離心收集細(xì)胞，用CTAB法提取DNA后進(jìn)行26S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA 1 μL、10×Taq buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 2.5 μL、10 mmol dNTP 2 μL，NL-1 1 μL，NL-4 1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O定容至總體積25 μL。PCR程序為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存[6]。26S rRNA基因的擴(kuò)增引物為NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，NL-4：5′-GGTCC GTGTTTCAAGACGG-3′。將擴(kuò)增出的26S rRNA基因序列克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。登錄NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）用BLAST程序進(jìn)行序列比對，下載序列，通過Mega軟件中的鄰接法（neighbor-Joining）進(jìn)行分析構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌形態(tài)觀察及聚類分析

經(jīng)分離純化，從樣品中共分離出41株酵母菌，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法觀察以及WL鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，依據(jù)在WL培養(yǎng)基上長出的酵母菌菌落形態(tài)和顏色特征，結(jié)合在PDA上生長的酵母菌菌落及菌體形態(tài)可初步將分離菌株分為15種形態(tài)類型（表1、圖1）。WL鑒別培養(yǎng)基生長鑒定結(jié)果見表2。初步分析顯示，石河子地區(qū)分離酵母菌形態(tài)類型較吐魯番地區(qū)多樣。

2.2 酵母菌生理生化分析

對經(jīng)初步篩選過的酵母菌分離株進(jìn)行糖發(fā)酵、碳同化以及溫度耐受性試驗（表2、表3），可以看出，不同的酵母菌株類型對不同碳源的利用各不相同，同時進(jìn)一步顯示了新疆不同地區(qū)酵母菌多樣性之間的差異和潛在的酵母菌資源。

2.3 酵母菌株26S rDNA測序分析

本研究在進(jìn)行酵母菌形態(tài)聚類分析和生理生化分析的基礎(chǔ)上，從每種形態(tài)類型中選擇1株酵母菌進(jìn)行26S rDNA基因擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在550～700 bp之間。然后將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序所得的序列在GenBank上進(jìn)行Blast比對，選取下載1～2個相似度較高菌株的26S rDNA序列，利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2、圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，各供試菌株與各自的模式菌株聚在一枝，并且相同種的菌株歸于同一分枝，具有較近的親緣關(guān)系，而不同種則位于不同分枝上。系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與26S rDNA D1/D2區(qū)堿基序列的同源率鑒定結(jié)果相一致。

2.4 不同地區(qū)酵母菌種群分布及優(yōu)勢類群

本研究在石河子和吐魯番釀酒葡萄園區(qū)分別采集葡萄樣品和土壤樣品，篩選出酵母菌株41株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步分為15類，選取分別來源于2個不同地區(qū)的代表性菌株28株， 對其進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增、 26S rDNA D1/D2區(qū)域序列鑒定，結(jié)果顯示，分離菌株屬于隱球酵母屬（Cryptococcus）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、棒孢酵母屬（Clavispora）、紅酵母屬（Rhodotorula）、假絲酵母屬（Candida）、Rhodosporidiobolus和Kazachstania，共9個屬15個種。石河子地區(qū)分離獲得酵母菌株28株，分別屬于烏茲別克斯坦隱球酵母（Cryptococcus uzbekistanensis）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、紅冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）、紅冬孢酵母（Rhodosporidium babjevae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、畢赤膜酵母（Pichia membranifaciens）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、Kazachstania hellenica和Rhodotorula nothofagi等10屬13種，優(yōu)勢酵母菌種為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），占分離菌株的 17.9%。吐魯番地區(qū)共分離獲得13株酵母菌，經(jīng)鑒定屬于葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、沼澤生紅冬孢酵母（Rhodosporidium paludigena）、Rhodosporidiobolus ruineniae和Kazachstania hellenica等6屬6種，優(yōu)勢酵母菌種為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae），占分離菌株的46.2%。

3 結(jié)論與討論

新疆地理環(huán)境特殊，不同地區(qū)有其獨特的生態(tài)環(huán)境，同時釀酒葡萄種植面積廣，不同產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境差異較大，因而酵母菌資源非常豐富[10]。本研究從2個釀酒葡萄園中共分離41株酵母菌，分布于9個屬15個種，分別為烏茲別克斯坦隱球酵母（Cryptococcus uzbekistanensis）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、 異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、紅冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）、紅冬孢酵母（Rhodosporidium babjevae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、畢赤膜酵母（Pichia membranifaciens）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、沼澤生紅冬孢酵母（Rhodosporidium paludigena）、Rhodotorula nothofagi、Kazachstania hellenica、Rhodosporidiobolus ruineniae，其中Clavispora lusitaniae、Kazachstania hellenica、Candida tropicalis和Cryptococcus flavescens在2個釀酒葡萄園中均有分布。此外，本研究結(jié)果顯示石河子葡萄園中分離的可培養(yǎng)酵母菌比吐魯番地區(qū)可培養(yǎng)酵母菌多樣性大。李雙石等研究山東蓬萊和甘肅武威的蛇龍珠葡萄附著酵母菌的種群多樣性及其生態(tài)分布特征發(fā)現(xiàn)，不同葡萄產(chǎn)區(qū)由于氣候、土壤和管理方式等不同，即使是同一葡萄品種分布的酵母菌種也存在差異[11]，本研究結(jié)果與之一致。本研究發(fā)現(xiàn)石河子釀酒葡萄園酵母菌優(yōu)勢菌種為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），占分離菌株的17.9%。吐魯番酵母菌優(yōu)勢菌種為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae），占分離菌株的46.2%。這與李艷等對沙城地區(qū)3個龍眼葡萄園酵母菌的研究結(jié)果[12]相一致，進(jìn)一步說明不同來源的土壤樣品中酵母菌群組成各不相同，優(yōu)勢菌種的類型也不相同。