姚昕利 舒文將 李鶴

摘要：以桂北金槐（Sophora japonica）為原料，優(yōu)選出蕓香苷的提取工藝，為該藥材的資源開發(fā)提供參考。選取蕓香苷含量為因變量，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取料液比、甲醇濃度、超聲功率為自變量，通過響應(yīng)面法優(yōu)選超聲波輔助提取金槐米蕓香苷的工藝并進行預(yù)測分析。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蕓香苷含量：流動相甲醇溶液（A）-0.5%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，檢測波長為260 nm。最佳提取工藝條件為超聲功率250 W;甲醇濃度88.87%;超聲時間60 min;料液比1 g ∶ 50 mL，蕓香苷在此提取預(yù)測值、驗證值分別為35.32%、33.19%，兩者相差不大。結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、預(yù)測性良好，能提高金槐槐米資源的合理利用，能為槐米蕓香苷制劑開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：金槐;超聲波輔助提取;響應(yīng)面法;蕓香苷;提取;HPLC

中圖分類號： R284.2 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0197-04

金槐（Sophora japonica）屬槐樹的栽培品種，以金黃色的槐米得名[1];相較其他地區(qū)的槐米，金槐含有豐富的蕓香苷，其蕓香苷含量可達25%～28%，遠遠高出普通槐米[2]。蕓香苷不僅藥理性強，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等作用，還能強化機體抵抗力、提升毛細(xì)管的彈性，因此在臨床上主要被用于治療腦出血、高血壓、心血管類疾病[3]，且被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、保健品、功能性食品中，而金槐作為廣西壯族自治區(qū)全州縣特有的品種，蕓香苷含量較高，具有很好的開發(fā)利用價值。目前對于金槐蕓香苷的提取優(yōu)化方案不是很明確，因此制定出規(guī)范高效的提取方法對現(xiàn)代藥學(xué)研究是非常有必要的。

蕓香苷的提取方法主要有堿提取酸沉淀法、熱水提冷析出法、大孔樹脂分離法、超聲輻射法、乙醇浸提法等，多存在提取效率低、成本高、工藝流程長、提取蕓香苷的純度差等問題[3-6]。近年來的研究表明，超聲波輔助提取蕓香苷的效果較好，提取率高且需時較少[7-8]。通過優(yōu)化、合理選擇提取工藝可以提高蕓香苷提取率，其中最常用的方法主要為（1）正交試驗;（2）響應(yīng)面法[9]。響應(yīng)面法試驗具有設(shè)計簡單、操作方便、精確度高等優(yōu)點[10-12]。本研究以蕓香苷含量為評價指標(biāo)，在等因素試驗基礎(chǔ)上，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化蕓香苷提取工藝，用高效液相色譜法（HPLC）測定其含量，為金槐槐米的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槐槐米（廣西壯族自治區(qū)全州縣，經(jīng)廣西植物研究所蔣運生研究員鑒定為槐米）、蕓香苷對照品（上海如吉生物科技有限公司，批號150706，純度≥95%），磷酸、甲醇為色譜純，水為超純水。試驗時間為2016年9月至2017年5月;地點為桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)];四兩裝高速中藥粉碎機（浙江省瑞安市永歷制藥機械有限公司生產(chǎn)）;DL-360D智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司生產(chǎn)）;高效液相色譜儀（島津制作所生產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取蕓香苷工藝 將槐米去雜，用高速中藥粉碎機粉碎成末后過60目篩，精確稱取1.00 g置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的甲醇溶液，在不同的料液比下于不同的超聲時間、超聲功率下提取，放冷后過濾。用相應(yīng)濃度的甲醇溶液定容至50 mL容量瓶中，取0.1 mL至100 mL容量瓶中，再次定容至刻度線，備用。

1.3.2 單因素分析 參考相關(guān)文獻[13]，以超聲時間（40 min）、料液比（1 g ∶ 25 mL）、甲醇濃度（60%）、超聲功率（400 W）為參考依據(jù)，為進一步剖析各因素與蕓香苷提取率的關(guān)系，確定試驗各單因素水平。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 確定自變量，具體依據(jù)單因素試驗結(jié)果，主要包括超聲功率、甲醇濃度、料液比;其中蕓香苷提取率為響應(yīng)值。結(jié)合Box-Behnken法，設(shè)計分析試驗，表1為各因素水平情況。

1.3.4 蕓香苷含量測定

1.3.4.1 色譜條件的選擇 采用C18柱，設(shè)定30 ℃柱溫，流速選取1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長設(shè)定為260 nm，流動相采用甲醇溶液（A）-0.5%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，試驗洗脫條件見表2。

1.3.4.2 蕓香苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取50 mL容量瓶，精確加入蕓香苷對照品4 mg，用甲醇溶液定容至刻度線后搖勻，備用。精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。按“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件進樣并測定其峰面積。試驗結(jié)果：在0.8～7.2 μg 范圍內(nèi)，蕓香苷的峰面積與濃度呈線性關(guān)系?；貧w方程為y=63 663x-4 754.5，R2=0.999 8。

1.3.4.3 精密度試驗 取“1.3.4.2”節(jié)中的對照品溶液，并結(jié)合“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣5次。每次進樣量為 10 μL，分別記錄峰面積值，結(jié)果表明，蕓香苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.032%，精密度高。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗 取適量金槐槐米樣品細(xì)粉，配制供試品溶液（5份），按照“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件分別測定峰面積。金槐槐米樣品蕓香苷提取率平均值為22.62%，RSD值為0.942%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.4.5 穩(wěn)定性試驗 在室溫下放置一供試品溶液，并分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h內(nèi)進樣，分別記錄相應(yīng)的峰面積值。結(jié)果蕓香苷峰面積的RSD值為1.201%，表明供試樣品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的金槐樣品粉末5份，并向其中分別加入蕓香苷對照品，按供試品測定方法測定，算得平均加樣回收率為99.45%，RSD值為1.54%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同甲醇濃度對蕓香苷提取率的影響 在固定料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲時間為60 min、超聲功率為350 W的條件下，考察甲醇濃度為60%、70%、80%、90%、100%時蕓香苷提取率的變化。由圖1可知，甲醇濃度為70%～90%時，隨甲醇濃度增大，蕓香苷提取率增加，當(dāng)濃度達到90%后提取率不再增加，說明此時蕓香苷能溶于甲醇溶液中的含量達到最大。這可能是因為甲醇溶液濃度過高時，會增加甲醇溶液的揮發(fā)，使得一些脂溶性物質(zhì)溶出，影響了蕓香苷的提取，致使蕓香苷提取率下降。所以確定最佳的甲醇濃度為90%。

2.1.2 不同超聲時間對蕓香苷提取率的影響 在甲醇溶液濃度為80%、料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲功率為350 W條件下，考察超聲時間為30、40、50、60、70 min時蕓香苷提取率的變化。由圖2可知，隨著超聲時間的延長，蕓香苷提取率呈現(xiàn)小幅度波動，但整體變化不大，其中提取率最大值出現(xiàn)在超聲時間為60 min 時。因此本試驗固定超聲時間為60 min。

2.1.3 不同料液比對蕓香苷提取率的影響 在固定甲醇溶液濃度為80%、超聲時間為60 min、超聲功率為350 W條件下，分別考察料液比為1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60 （g ∶ mL）時蕓香苷提取率的變化。由圖3可知，蕓香苷提取率隨溶劑體積的增加而增加，這是因為溶劑和蕓香苷的接觸面積增大使蕓香苷更易溶出;但當(dāng)料液比達到 1 g ∶ 50 mL 之后，隨著料液比繼續(xù)增加提取率趨于穩(wěn)定。因此確定最佳料液比為1 g ∶ 50 mL。

2.1.4 不同超聲功率對蕓香苷提取率的影響 在固定甲醇溶液濃度為80%、料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲時間為 60 min 條件下，考察超聲功率200、250、300、350 W時蕓香苷提取率的變化。由圖4可知，蕓香苷提取率在250～350 W范圍內(nèi)呈上升趨勢，且在 350 W 時達到最大，即本試驗選取 350 W 為最佳超聲功率。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比、甲醇溶液濃度、超聲功率為主要因素，根據(jù)Box-Behnken Design試驗設(shè)計原理，對考察因素和其水平進行設(shè)計，其中分析因子12個、零點5個，共17個試驗點，零點試驗進行5次，以估計誤差，結(jié)果見表3。

多元擬合分析，主要運用Design-Expert 8.0軟件及表3獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)，得出如下擬合方程：Y=22.62+4.62A+0.57B-1.03C+0.75AB-2.91AC-1.20BC-4.68A2-0.58B2+0.80C2;Y表示提取率。由表4可知， 試驗?zāi)Ｐ惋@著性值小于0.01，說明試驗?zāi)Ｐ椭械亩検椒匠梯^符合實際提取情況，較好地反映了料液比、甲醇溶液濃度和超聲功率與蕓香苷提取率間的關(guān)系，并且表明甲醇溶液濃度和料液比間、甲醇溶液濃度和超聲功率間以及料液比和超聲功率間的交互作用對蕓香苷提取率的影響極顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析因素之間的交互作用 圖5為超聲功率300 W條件下，甲醇溶液濃度和料液比的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖。由圖5可知，當(dāng)甲醇溶液濃度和料液比較小時，提取率變化較大;且甲醇濃度和料液比逐漸增大到較大值時，提取率也逐漸增大;當(dāng)增大到一定水平時，提取率卻逐漸下降，說明甲醇溶液濃度和料液比2個因素交互作用明顯。當(dāng)料液比一定時，增加甲醇溶液濃度不一定會提高提取率，可能是因為甲醇濃度增大使得金槐中的脂溶性物質(zhì)溶解量增多，從而抑制了蕓香苷的溶解。

圖6為甲醇溶液濃度和超聲功率的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖，固定料液比為 1 g ∶ 40 mL。蕓香苷提取率在甲醇溶液濃度、超聲功率較小時變化較大;當(dāng)超聲功率處于低水平，而甲醇溶液濃度處于高水平時，蕓香苷提取率達到最高;當(dāng)超聲功率一定時，隨著甲醇濃度的增加，蕓香苷提取率的變化較大，說明這2個因素間的交互作用明顯。

圖7為料液比和超聲功率的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖，固定甲醇濃度為80%。由圖7可知，當(dāng)料液比較大時，蕓香苷提取率隨著超聲功率的增大逐漸減小;而當(dāng)超聲功率一定時，蕓香苷提取率隨著料液比的增大卻不一定增加，說明2個因素間的交互作用明顯，且當(dāng)料液比處于高水平，超聲功率處于低水平時達到最大值。

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗證 結(jié)合Design-Expert 8.0，綜合分析與試驗可操作性、蕓香苷提取率有關(guān)的各個因素，得出最優(yōu)超聲工藝為甲醇濃度88.87%，料液比 1 g ∶ 50 mL，超聲功率250 W，此時蕓香苷提取率的預(yù)測值為35.32%。采用上述最優(yōu)工藝進行驗證， 重復(fù)試驗3次， 得到蕓香苷提取率為33.19%，與預(yù)測值相差無幾，說明該超聲輔助工藝準(zhǔn)確性和可靠性高。

3 討論

選擇全面試驗中最具代表性的部分，結(jié)合試驗、極差分析，并獲得最優(yōu)因素組合的方法即為正交試驗法，此法具有簡單易行的特點，但不能對各個因素效應(yīng)、交互作用進行分析[9]。而響應(yīng)面法則針對具體范圍利用爬坡試驗得出可代表各因素交互關(guān)系的條件組合，此法更具直觀性、精確性[10-11]。

本研究以廣西壯族自治區(qū)桂北金槐槐米為試驗對象，甲醇超聲為提取方法優(yōu)選出金槐槐米中蕓香苷的最佳提取方法。超聲提取具有操作簡單、提取效率高的優(yōu)勢，且超聲提取為物理方法，在提取過程中能避免有效成分被破壞。同時采用Design-Expert 8.0軟件，對超聲波輔助提取法提取蕓香苷工藝進行優(yōu)化，與傳統(tǒng)的優(yōu)化方法——正交試驗法或均勻設(shè)計法相比，能通過直觀的圖形、精確度較高的數(shù)學(xué)模型對最佳工藝進行優(yōu)化，具有信息量大、直觀、數(shù)據(jù)處理能力較高且能反映各個因素之間交互作用的優(yōu)點。本研究得到響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助法提取槐米的最佳工藝為料液比 1 g ∶ 50 mL、超聲功率250 W、甲醇濃度88.87%。擇優(yōu)選取的提取工藝不僅操作簡單而且提取效率更高，有利于縮短提取時間，為進一步開發(fā)金槐中的蕓香苷提供了科學(xué)合理的理論和試驗依據(jù)。

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