崔桂彩 付童童 孫川惠

摘要：擬用中花11水稻（Oryza sativa L.）分析谷胱甘肽（glutathione，簡稱GSH）及其合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺（buthionine sulfoximine，簡稱BSO）處理對水稻幼苗根系生長及生長素和細胞周期基因表達的影響。結(jié)果表明，在處理后5～9 d時，GSH促進了水稻根系，特別是側(cè)根的形成和生長，而BSO則顯著抑制了根系的生長。對用GSH、BSO處理6 d時的DR5-GUS[GUS（β-glucuronidase）是β-葡萄糖苷酸酶]轉(zhuǎn)基因水稻（以中花11號為背景）分析發(fā)現(xiàn)，GSH加快了生長素在根系的梯度分布，而BSO則延緩了生長素的梯度分布，引起生長素在初生根根尖的過度積累。從分子水平分析顯示，GSH、BSO處理后6 d時，水稻幼苗根系中分別有23個生長素基因（如OsYUCCA7、OsPIN1c、OsARF1和OsIAA7等）和19個細胞周期基因（如Oryza;CycA3;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CDKC;2和Oryza;KRP;1等）的表達有明顯差異。以上試驗結(jié)果表明，GSH是調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長的重要信號分子，它可能通過影響這些生長素和細胞周期基因的表達及生長素的分布而參與水稻根系生長的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞：谷胱甘肽;生長素基因;水稻根系;細胞周期基因

中圖分類號： S511.01 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0069-04

谷胱甘肽（glutathione，簡稱GSH）是植物細胞內(nèi)的主要抗氧化劑和信號分子之一，在植物的生長發(fā)育和抗逆過程中有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。研究表明，GSH可以促進番茄再生根的形成，但是會抑制其伸長生長，此外，GSH合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺（buthionine sulfoximine，簡稱BSO）也會抑制再生根的伸長生長，而對再生根的數(shù)量沒有明顯影響[2]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加生長素會明顯提高再生根中的GSH水平，從而抑制根的生長，說明在器官形成過程中生長素和GSH之間存在一定的聯(lián)系。BSO阻滯擬南芥初生根的生長，抑制其生長素運輸基因PIN1、PIN2、PIN7的表達和生長素在根尖的積累[1]，但是對不定根的PIN1表達無影響。Cheng等的報道表明，增加GSH含量，會提高擬南芥對干旱和高鹽等逆境的抗性，激活生長素合成基因（如YUC2）的表達，調(diào)節(jié)細胞分裂相關(guān)基因的表達[3]。在擬南芥阻斷根生長突變體rootmeristemless1中，GSH的合成強烈減少，該突變體的表型與BSO引起的生長阻滯類似[4]。GSH是維持擬南芥根分生組織細胞分裂必需的信號分子，添加外源谷胱甘肽會促進細胞分裂，相反，添加BSO會抑制細胞分裂[5]。在植物細胞早期分裂過程中，GSH和DNA共存于細胞核內(nèi)，從G1期到S期，GSH對維持核內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡和基因表達起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。GSH調(diào)節(jié)擬南芥細胞周期相關(guān)基因如RCK和SAP的表達[3]。這些研究表明，GSH在對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)與生長素和細胞分裂之間有密切關(guān)系。本試驗旨在通過分析GSH和BSO對水稻幼苗根系生長、生長素分布及生長素和細胞周期基因表達的影響，探討GSH調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

采用中花11號水稻（Oryza sativa L.）種子（由山東理工大學(xué)植物逆境實驗室保存），去殼后依次用75%乙醇（處理30 s）、0.1%氯化汞（處理15 min）、2%次氯酸鈉（處理20 min）消毒，再用滅菌水沖洗干凈。將種子分別植入含有 5 mmol/L GSH與 0.1 mmol/L 谷胱甘肽合成抑制劑BSO的MS培養(yǎng)基上，于 光—暗周期為14 h—10 h、光照度為 200 μmol/（m2·s）、晝—夜溫度周期為26 ℃—20 ℃、相對濕度約為50%～60%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)3～9 d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。每個處理獨立重復(fù)3次，每次設(shè)3個平行處理。

1.2 根系生長指標(biāo)的統(tǒng)計

根系生長指標(biāo)的統(tǒng)計包括所有根（初生根、不定根和側(cè)根）的數(shù)量和長度，每個獨立重復(fù)至少統(tǒng)計20株，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用每株的平均值來表示。

1.3 根系生長素分布的測定

將DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻（以水稻中花11號為背景）種子滅菌消毒后，分別植入含有5 mmol/L GSH和0.1 mnol/L BSO的MS培養(yǎng)基上，在上述同樣條件下培養(yǎng)6 d，然后進行GUS（β-glucuronidase，即β-葡萄糖苷酸酶）活性測定，分析根系生長素的分布和積累變化[7]。每個處理至少設(shè)20株。

1.4 根系生長素和細胞周期基因轉(zhuǎn)錄活性的分析

將中花11號水稻種子消毒后，分別植入含有5 mmol/L GSH和0.1 mmol/L BSO的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d（培養(yǎng)條件同“1.1”節(jié)），用TRIzol試劑提取總RNA，取1 μg RNA，用TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有處理用等量cDNA進行PCR反應(yīng)，以O(shè)sactin1基因作內(nèi)標(biāo)，采用Gel-Pro Analyzer軟件對基因轉(zhuǎn)錄活性進行半定量分析。將對照的轉(zhuǎn)錄活性設(shè)置為1，基因表達水平≥1.3為上調(diào)，≤0.7為下調(diào)。每種處理的PCR反應(yīng)在相同條件下獨立重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用單因素方差分析不同處理之間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

1.6 試驗時間和地點

本研究所有試驗均于2015年9月至2017年3月進行，在山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)等相關(guān)實驗室完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH、BSO對水稻幼苗根系生長的影響

2.1.1 GSH、BSO對水稻幼苗初生根長度及其側(cè)根數(shù)量和長度的影響 與對照組相比，水稻幼苗在處理后5～9 d期間，BSO顯著抑制了初生根的伸長生長，而GSH則促進了其生長（圖1-A）。如試驗后7 d時，BSO處理的初生根長度比對照降低了49.7%（P<0.01），試驗后5 d時，GSH處理的初生根長度比對照增加了37.6%（P<0.01）。由圖1-B可見，GSH處理7～9 d時，初生根上側(cè)根的數(shù)量比對照顯著增加;相反，在相同的時間內(nèi)，BSO處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量明顯比對照的少。如試驗后9 d時，GSH處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量比對照增加了32.6%（P<0.01），而BSO處理的初生根上的側(cè)根數(shù)量比對照減少了52.5%（P<0.01）。與對照相比，BSO極顯著抑制了初生根上側(cè)根的伸長生長（P<0.01），GSH則在一定程度上促進了其生長（圖1-C）。

2.1.2 GSH、BSO對水稻幼苗不定根數(shù)量和長度的影響 由圖2可以看出，在試驗后3～9 d期間，水稻幼苗不定根的數(shù)量（圖2-A）和長度（圖2-B）有與圖1類似的變化趨勢，其中BSO處理的不定根數(shù)量和長度明顯不及對照。試驗后9 d時，BSO處理的不定根的數(shù)量、長度分別比對照減少了52.5%、52.6%，且與其他處理差異極顯著（P<0.01），但是GSH處理的不定根數(shù)量和長度與對照之間差異不顯著。

2.1.3 GSH、BSO對水稻幼苗不定根上側(cè)根數(shù)量和長度的影響 用GSH處理7～9 d時，水稻幼苗不定根上的側(cè)根數(shù)量（圖3-A）、長度（圖3-B）都比對照的顯著增加?？梢奊SH加快了不定根上側(cè)根的形成和生長。如GSH處理9 d時，不定根上側(cè)根的數(shù)量比對照的增加了3.4倍（P<0.01）。相反，在整個試驗期間BSO處理完全抑制了水稻幼苗不定根上側(cè)根的形成（P<0.01）。

2.2 GSH、BSO對水稻幼苗根系生長素積累和分布的影響

生長素的積累和梯度分布對水稻幼苗根系的生長和發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用。為進一步了解 GSH、BSO處理對水稻根系生長的影響與生長素積累和分布之間的關(guān)系，本試驗用DR5-GUS轉(zhuǎn)基因水稻分析了GSH、BSO處理6 d的根系生長素變化。由圖4可見，與對照組相比，GSH加快了生長素在整個根系的梯度分布，減少了生長素在初生根根尖的過度積累，促進了側(cè)根的形成和發(fā)育。相反，BSO則延遲了生長素的梯度分布，引起生長素在根尖的過量積累，阻滯了側(cè)根的形成。

2.3 GSH、BSO對水稻幼苗根系生長素基因表達的影響

生長素在根系的積累和分布與生長素信號途徑上關(guān)鍵基因家族OsYUCCAs（生長素合成）、OsPINs（生長素極性運輸）和OsARFs/OsIAAs（生長素應(yīng)答）基因的表達有關(guān)。本試驗比較分析了GSH、BSO處理6 d的水稻幼苗根系中62個生長素基因表達的變化。結(jié)果顯示，與對照相比，GSH、BSO處理引起表達變化的基因有23個（圖5），其中GSH處理后表達上調(diào)的基因有6個，分別是OsYUCCA7、OsPIN1c、OsPIN10b、OsARF7、OsARF8、OsARF25;BSO處理后表達上調(diào)的基因有15個，包括OsYUCCA3、OsYUCCA6、OsYUCCA7、OsPIN1a、OsARF1、OsARF2、OsARF6、OsARF19、OsARF21、OsIAA7、OsIAA17、OsIAA21、OsIAA23、OsIAA24和OsIAA27，表達下調(diào)的基因有6個，包括OsPIN1c、OsARF7、OsARF8、OsARF15、OsARF17和OsIAA19。以上結(jié)果表明，GSH、BSO處理對根系生長素積累和分布的影響可能與生長素基因的差異表達有密切關(guān)系。

2.4 GSH、BSO對水稻幼苗根系細胞周期基因表達的影響

細胞周期調(diào)控是控制水稻根系生長發(fā)育的重要因素之一。為進一步分析GSH、BSO處理對根系生長的影響與細胞周期之間的關(guān)系，本試驗檢測了GSH、BSO處理6 d的水稻幼苗根系中56個細胞周期核心基因表達的變化情況。由圖6可見，與對照相比，GSH、BSO處理后有19個基因的表達發(fā)生了明顯變化，其中GSH激活表達的基因有6個，分別是Oryza;CycA2;1、Oryza;CycA3;1、Oryza;CycB2;1、Oryza;CycL1;1、Oryza;CDKC;2和Oryza;RB;1，抑制表達的基因也有6個，包括Orysa;CycB1;1、Oryza;CycD2;2、Oryza;CycD4;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CycD6;1和Oryza;CDKC;3。BSO上調(diào)表達的基因有4個，分別是Oryza;CycA3;2、Oryza;CycD6;1、Oryza;KRP;1和Oryza;RB;1，下調(diào)表達的基因有13個，包括Oryza;CycA2;1、Oryza;CycA3;1、Orysa;CycB1;1、Oryza;CycB1;2、Oryza;CycB2;1、Oryza;CycD2;2、Oryza;CycD7;1、Oryza;CycL1;1、Oryza;CDKA;1、Oryza;CDKB;2、Oryza;CDKC;2、Oryza;CDKC;3和Oryza;CDKF;3。值得注意的是，本試驗中的BSO抑制了Oryza;CycA2;1等多數(shù)細胞周期進程中的正調(diào)控基因的表達，而促進了負調(diào)控基因Oryza;KRP;1、Oryza;RB;1的表達，因此BSO對水稻幼苗根系，特別是側(cè)根的形成和發(fā)育的抑制作用與其阻滯細胞分裂有很大關(guān)系。

3 討論

有研究表明，在根系形成過程中，生長素和GSH之間存在一定聯(lián)系，適量的GSH有利于根系的生長，而GSH含量過高或過低都會抑制根的生長[2]，BSO會抑制擬南芥初生根的生長[1]。本試驗得到類似的結(jié)果，即GSH促進了水稻幼苗特別是側(cè)根的形成和發(fā)育，而BSO則顯著抑制了初生根、不定根和側(cè)根的生長。Koprivova等研究發(fā)現(xiàn)，BSO抑制生長素運輸基因PIN1、PIN2和PIN7的表達和生長素在根尖的積累[1]。Cheng等報道，外源GSH激活了生長素合成基因（如YUC2）的表達[3]。本試驗結(jié)果也表明，GSH、BSO對生長素信號途徑上某些關(guān)鍵基因（如OsYUCCA7、OsPIN1c、OsARF1和OsIAA7等）的表達調(diào)節(jié)存在明顯差異，它們可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達來影響生長素在根系的梯度分布，進而調(diào)控根系的生長和發(fā)育。細胞周期是調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。GSH是維持擬南芥根分生組織細胞分裂必需的信號分子。添加外源GSH可促進細胞分裂，調(diào)節(jié)擬南芥細胞周期相關(guān)基因如（RCK和SAP）的表達[3]。相反，添加BSO會抑制細胞分裂[5]。在本試驗中，在GSH、BSO處理條件下有19個細胞周期基因（如Oryza;CycA3;1、Oryza;CycD4;2、Oryza;CDKC;2和Oryza;KRP;1等）的表達差異顯著。特別值得注意的是，BSO抑制了多數(shù)細胞周期正調(diào)控基因如Oryza;CycA3;1的表達，而激活了負調(diào)控基因如Oryza;KRP;1的表達，推測BSO對根系生長的抑制作用可能與其延緩細胞分裂進程有密切關(guān)系。本試驗結(jié)果表明，GSH是調(diào)節(jié)水稻幼苗根系生長的重要信號分子，它可能通過影響生長素和細胞周期基因表達及生長素分布而參與水稻根系生長的調(diào)節(jié)。

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