俞飛飛 周軍永 陸麗娟

摘要：利用反向序列標(biāo)簽重復(fù)技術(shù)（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）對(duì)43份安徽省榧樹(shù)種質(zhì)資源及3份浙江省榧樹(shù)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。ISTR能很好地用于榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，多態(tài)性比例為87.09%，46份榧樹(shù)種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為0.548 4～1.000 0，表明安徽省榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。采用UPGMA（非加權(quán)組平均算法）對(duì)46份種質(zhì)的ISTR數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示可分為3個(gè)類(lèi)群，來(lái)自同一地方的種質(zhì)基本上都獨(dú)立聚成類(lèi)群，表明種質(zhì)間親緣關(guān)系與地理來(lái)源關(guān)系較為密切;相似的種質(zhì)類(lèi)型聚為一類(lèi)，可能與實(shí)生繁殖方式有關(guān)。ISTR標(biāo)記可在榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中被廣泛地應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：香榧;反向序列標(biāo)簽重復(fù)技術(shù);遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S791.530.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0038-03

榧樹(shù)（Torreya grandis）屬裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木，為第3紀(jì)孑遺植物，是我國(guó)特有的珍稀樹(shù)種。安徽省榧樹(shù)種質(zhì)資源豐富，多呈野生或半野生狀態(tài)，主要分布于黃山市的黟縣、休寧縣、歙縣、徽州區(qū)和黃山區(qū)，宣城市的寧國(guó)市、宣州區(qū)和績(jī)溪縣，池州市的石臺(tái)縣有少量分布，此外，大別山區(qū)的霍邱、舒城等地也有零星分布[1-6]。

反向序列標(biāo)簽重復(fù)技術(shù)（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）是逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記，較常規(guī)分子標(biāo)記靈敏[7]，使用的是通用引物，免去了前期逆轉(zhuǎn)座子特異引物開(kāi)發(fā)步驟，降低了試驗(yàn)成本和提高了效率。目前已在椰子[8]、葡萄[9]、柑橘[10]和柿[11]等果樹(shù)樹(shù)種的指紋分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)進(jìn)化分析和種質(zhì)鑒定等研究中得到應(yīng)用。

隨著香榧經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不斷提高，榧樹(shù)的種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)和利用受到重視，特別注重優(yōu)良品質(zhì)的榧樹(shù)資源利用，同時(shí)受到來(lái)自諸暨香榧等細(xì)榧品種的影響，安徽省很多野生和半野生的榧樹(shù)被改接，從而造成榧樹(shù)種質(zhì)資源的流失，并且前人對(duì)安徽省榧樹(shù)資源遺傳多樣性的研究很少。本試驗(yàn)擬探討ISTR標(biāo)記在榧樹(shù)種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析中應(yīng)用的可行性，以期為今后開(kāi)展遺傳多樣性評(píng)價(jià)、雌雄性別鑒定、種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析等研究提供新的研究手段，對(duì)榧樹(shù)資源的保存利用具有重要的研究意義。

1 材料與方法

本研究中所采用的榧樹(shù)種質(zhì)資源共46份（表1），于2017年6月采自安徽省榧樹(shù)主產(chǎn)區(qū)的寧國(guó)市、黟縣、宣城等地;其中諸暨香榧引自浙江省諸暨市。試驗(yàn)于2017年8月在園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取榧樹(shù)葉片DNA，DNA終濃度稀釋至10 ng/μL備用。ISTR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測(cè)參考Rohde的方法并作優(yōu)化[8]。引物序列參考Aga等的報(bào)道[12]（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系（20 μL）：模板DNA（2 μL），Buffer 1×（5 μL），Mg2+ 2.5×10-3 mol/L（5 μL），dNTP 2.5×10-3 mol/L（5 μL），Taq酶1 U（1 μL），引物1.0×10-6 mol/L（2 μL）。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次;72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察和記錄譜帶。

PCR擴(kuò)增試驗(yàn)重復(fù)2次，不能重復(fù)的條帶統(tǒng)計(jì)時(shí)忽略不計(jì)。強(qiáng)帶、弱帶均記為1，同一位置無(wú)帶記為0，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。用NTSYS-pc 2.10軟件進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算和基于非加權(quán)組平均算法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚類(lèi)分析，構(gòu)建樹(shù)狀圖，分析榧樹(shù)種質(zhì)資源親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISTR多態(tài)性分析

共篩選12對(duì)引物，其中4對(duì)引物的擴(kuò)增譜帶清晰且重復(fù)性好。由表3可見(jiàn)，4對(duì)引物的擴(kuò)增總帶數(shù)為31條，27條（占87.10%）具多態(tài)性;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100～5 000 bp;單引物對(duì)多態(tài)位點(diǎn)比例為77.78%～100%;不同引物組合的種質(zhì)鑒定能力差異較大，4對(duì)引物組合可以將46份種質(zhì)資源按來(lái)源地區(qū)分，證明ISTR可用于榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。

2.2 品種及雌雄性鑒別

由4條引物擴(kuò)增出的27個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，大多數(shù)譜帶在供試材料間不具有獨(dú)特性，來(lái)自寧國(guó)市方塘鄉(xiāng)的種質(zhì)資源和諸暨香榧多態(tài)性豐富，能與其他種質(zhì)資源明顯區(qū)分。圖1結(jié)果顯示， 17號(hào)樣本為雄性榧樹(shù)，在500 bp左右出現(xiàn)獨(dú)特性擴(kuò)增位點(diǎn)，與雌性榧樹(shù)有明顯區(qū)分，作為雌雄性鑒定的依據(jù)有待于進(jìn)一步研究。

2.3 基于ISTR的相似指數(shù)及親緣關(guān)系分析

46份榧樹(shù)種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為0.548 4～1.000 0，表明安徽榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富，其中來(lái)自黟縣的圓榧類(lèi)種質(zhì)的相似系數(shù)最大，為1.000 0，表明圓榧類(lèi)的親緣關(guān)系最近。

采用UPGMA法，根據(jù)相似系數(shù)對(duì)46份榧樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖2），在相似系數(shù)為0.82時(shí)，46份種質(zhì)可分為3個(gè)類(lèi)群。第1類(lèi)群包含2份種質(zhì)，來(lái)自寧國(guó)市方塘鄉(xiāng)。

第2類(lèi)群包含7份種質(zhì)，以相似系數(shù)0.87為界，可分為2個(gè)亞類(lèi)，第1亞類(lèi)包含4份種質(zhì)，其中寧國(guó)市方塘鄉(xiāng)3份，寧國(guó)市青龍鄉(xiāng)1份;第2亞類(lèi)含有3份種質(zhì)，其中2份來(lái)自浙江?。ㄖT暨香榧），1份來(lái)自安徽省寧國(guó)市方塘鄉(xiāng)。

第3類(lèi)群含有37份種質(zhì)，以相似系數(shù)0.91為界，分為4個(gè)亞類(lèi)。第1亞類(lèi)包含30份種質(zhì)，第2亞類(lèi)僅含有1份種質(zhì)（來(lái)自宣城市水東鎮(zhèn)），第3亞類(lèi)包含5份種質(zhì)，全部來(lái)自寧國(guó)市青龍鄉(xiāng)，第4亞類(lèi)包含1份種質(zhì)（來(lái)自寧國(guó)市青龍鄉(xiāng)）。在相似系數(shù)0.94處，第1亞類(lèi)可分為5小類(lèi)，第1小類(lèi)包含8份種質(zhì)，其中2份種質(zhì)來(lái)自寧國(guó)市，1份種質(zhì)來(lái)自宣城市，5份種質(zhì)來(lái)自黟縣（5份種質(zhì)聚為一類(lèi)，且圓榧類(lèi)種質(zhì)親緣關(guān)系近，聚為一類(lèi)）;第2小類(lèi)包含4份種質(zhì)，3份來(lái)自宣城市，1份來(lái)自寧國(guó)市;第3小類(lèi)包含17份種質(zhì)，8份來(lái)自宣城市，1份來(lái)自浙江?。ㄖT暨香榧），8份來(lái)自黟縣，其中來(lái)自黟縣的多為圓榧類(lèi)種質(zhì)，且聚為一類(lèi);第4小類(lèi)僅包含1份種質(zhì)（來(lái)自宣城市溪口鎮(zhèn)）。

3 討論

本研究中所使用的ISTR分子標(biāo)記是基于椰子Ty1-copia逆轉(zhuǎn)座子序列開(kāi)發(fā)而來(lái)的[8，12]，試驗(yàn)的目的在于探討ISTR分子標(biāo)記在榧樹(shù)種質(zhì)資源中的適用性及其用于研究榧樹(shù)資源親緣關(guān)系的可行性。本試驗(yàn)中ISTR多態(tài)性比例為8709%，多態(tài)性比例較高，且關(guān)于榧樹(shù)逆轉(zhuǎn)座子標(biāo)記未見(jiàn)報(bào)道， 使用通用引物較以特異性引物開(kāi)發(fā)為前提的逆轉(zhuǎn)座子標(biāo)

記成本低，因此ISTR是較便捷的逆轉(zhuǎn)座子標(biāo)記。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，46份榧樹(shù)種質(zhì)遺傳相似系數(shù)為 0.548 4～1.000 0，榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示第1類(lèi)群全部來(lái)自寧國(guó)市方塘鄉(xiāng);第2類(lèi)群包含7份種質(zhì)，其中5份來(lái)自寧國(guó)市，2份來(lái)自浙江?。ㄖT暨香榧）;46份種質(zhì)中的37份屬于第3類(lèi)群，基本包含了所有的采樣地區(qū)，其中第1亞類(lèi)包含30份種質(zhì)，第2亞類(lèi)僅含有1份種質(zhì)（來(lái)自宣城市水東鎮(zhèn)），第3亞類(lèi)包含5份種質(zhì)，全部來(lái)自寧國(guó)市青龍鄉(xiāng)，第4亞類(lèi)包含1份種質(zhì)（來(lái)自寧國(guó)市青龍鄉(xiāng)）。第1亞類(lèi)又分為5小類(lèi)，第1小類(lèi)包含8份種質(zhì)，其中2份種質(zhì)來(lái)自寧國(guó)市，1份種質(zhì)來(lái)自宣城市，5份種質(zhì)來(lái)自的黟縣;第2小類(lèi)包含4份種質(zhì)，3份來(lái)自宣城市，1份來(lái)自寧國(guó)市;第3小類(lèi)包含17份種質(zhì)，8份來(lái)自宣城市，1份來(lái)自浙江?。ㄖT暨香榧），8份來(lái)自黟縣，其中來(lái)自黟縣的多為圓榧類(lèi)種質(zhì)，且聚為一類(lèi);第4小類(lèi)僅包含1份種質(zhì)（來(lái)自宣城市溪口鎮(zhèn)）。由于安徽省榧樹(shù)資源分布呈現(xiàn)地域性，在相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境中進(jìn)化;同一地理來(lái)源的種質(zhì)間基因交流頻繁，從而使親緣關(guān)系較近，遺傳變異系數(shù)相對(duì)較低;遺傳距離與地理距離具有一定的相關(guān)性，安徽省榧樹(shù)資源中來(lái)自同一區(qū)域的多聚為小類(lèi)，但聚為一類(lèi)的榧樹(shù)種質(zhì)并非都來(lái)自同一地區(qū)，這可能與地區(qū)之間的引種有關(guān)，也可能與本試驗(yàn)所選用的ISTR引物數(shù)量有限相關(guān)。此外，遺傳多樣性水平受繁育方式影響[13]，來(lái)自黟縣的種質(zhì)資源多為圓榧類(lèi)，親緣關(guān)系非常近，聚在一起，這可能與長(zhǎng)期的實(shí)生播種繁殖方式有關(guān)。

本研究中所選的引物擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)在供試材料間具有獨(dú)特性，來(lái)自寧國(guó)市方塘鄉(xiāng)的榧樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。利用F8/B6引物組合進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，17號(hào)樣本（雄株）在500 bp左右出現(xiàn)獨(dú)特性擴(kuò)增位點(diǎn)，與雌性榧樹(shù)有明顯區(qū)分，其特異性位點(diǎn)擴(kuò)增作為雌雄性鑒定的依據(jù)有待于進(jìn)一步研究。

本研究中ISTR產(chǎn)物使用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)手段獲得較好的結(jié)果，表明高濃度瓊脂糖凝膠電泳可用于檢測(cè)ISTR產(chǎn)物，提高了試驗(yàn)效率[11]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)部分引物擴(kuò)增結(jié)果時(shí)，條帶有密集現(xiàn)象;目前報(bào)道多采用的聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測(cè)方式具有分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，今后應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康摹⑦z傳背景等方面選擇ISTR產(chǎn)物檢測(cè)方式。

安徽省榧樹(shù)種質(zhì)資源豐富，其中不乏新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良株系[1]，但野生榧樹(shù)的低收益，使得農(nóng)戶(hù)疏于管理或改接為諸暨香榧，從而造成榧樹(shù)種質(zhì)資源的逐年減少，分析安徽省榧樹(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性有助于了解其親緣關(guān)系和從中篩選優(yōu)良株系。本試驗(yàn)探討ISTR標(biāo)記在榧樹(shù)種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析中應(yīng)用的可行性，以期為今后開(kāi)展遺傳多樣性評(píng)價(jià)、雌雄性別鑒定、種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析等研究提供新的研究手段，對(duì)榧樹(shù)資源的保存利用具有重要的研究意義。

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