石洪玥 陸穎 盧正義

摘要：采用牛津杯法比較不同鹽度（0、1%、2%、3%、4%）下五倍子、石榴皮、訶子、黃芩、烏梅5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果，測(cè)定了最小抑菌濃度。結(jié)果表明，5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌都有不同程度的抑菌效果，其中黃芩和五倍子抑菌作用較強(qiáng)，烏梅抑菌作用較差，而訶子和石榴皮的抑菌作用一般，但石榴皮對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌作用較為明顯。不同鹽度下，5種中草藥對(duì)這2種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）有差異。高鹽度時(shí)，5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的MIC較低，均≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而低鹽度時(shí)，各個(gè)中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。在鹽度為0時(shí)，5種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC最低，抑菌效果最好。

關(guān)鍵詞：鹽度;中草藥;遲緩愛(ài)德華氏菌;嗜水氣單胞菌抑菌;抑菌效果

中圖分類號(hào)： S942;S941.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0162-04

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）是2種常見(jiàn)的水產(chǎn)動(dòng)物致病菌，引起水產(chǎn)動(dòng)物大量死亡，對(duì)水產(chǎn)業(yè)造成重大威脅[1-5]。目前，對(duì)于各種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的防御多采用抗生素和化學(xué)藥物，但抗生素和化學(xué)藥物長(zhǎng)時(shí)間使用具有諸多弊端，如增強(qiáng)致病菌的耐藥性、造成養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留量日趨增多、使養(yǎng)殖水環(huán)境受到污染、引起過(guò)敏反應(yīng)等，這些都導(dǎo)致抗生素和化學(xué)藥物的使用受到限制[6-7]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的中草藥被用于防治細(xì)菌性傳染病。中草藥作為一種天然藥物，可直接作用于細(xì)菌等微生物的結(jié)構(gòu)和代謝而發(fā)揮其抗菌作用。研究表明，許多中草藥具有明顯的殺菌抑菌作用，并具有無(wú)抗藥性、無(wú)殘留及不會(huì)引起藥源性疾病等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。開(kāi)展抗菌中草藥的篩選和應(yīng)用研究對(duì)于動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治具有重要意義[11]。

目前，關(guān)于中草藥對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑菌、殺菌研究報(bào)道較多[12-17]，但中草藥在不同鹽度下的抑菌、殺菌作用未見(jiàn)報(bào)道。鑒于水體鹽度對(duì)中草藥的抑菌效果影響較大[6]，因此研究中草藥在不同鹽度下的抑菌效果，更具指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)在現(xiàn)有報(bào)道的基礎(chǔ)上[6-9，11-15]，篩選出五倍子（Rhus chinensis）、烏梅（Scutellaria baicalensis）、石榴皮（Terminalia chebula）、黃芩（Prunus mume）和訶子（Punica granatum）5種抑菌、殺菌效果明顯的中草藥，比較它們?cè)诓煌}度下（0、1%、2%、3%、4%）對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果，為上述5種中草藥在不用鹽度養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 五倍子、黃芩、訶子、烏梅、石榴皮5種中草藥購(gòu)自天津市某大藥房，粉碎后保存?zhèn)溆?。試?yàn)于5月中旬在天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;Mueller-Hinton培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)菌種 遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌均由天津農(nóng)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行菌種活化。取已滅菌離心管，分別加入 1 mL 生理鹽水備用。再用接種環(huán)從盛有源菌的培養(yǎng)基中沾取源菌，將其放入上述盛有生理鹽水的離心管中，充分混勻成菌溶液備用。

分別吸取2種菌溶液各100 μL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，后用生理鹽水沖洗培養(yǎng)基獲得菌液，并放入4 ℃冰箱中保存，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板估算菌液濃度約為2×109 CFU/mL，使用時(shí)用生理鹽水稀釋成濃度約為108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 試驗(yàn)藥物的制備 使用水提法[18-19]制備試驗(yàn)藥液。五倍子、黃芩、訶子、烏梅、石榴皮各取50 g于燒杯中，分別加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，并用玻璃棒不斷攪動(dòng)，待煮沸后用文火煮30 min，濾出藥液，繼續(xù)加水煎煮，重復(fù)3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至250 mL，所得中草藥水提物折合成生藥為200 mg/mL，高壓蒸汽滅菌后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前充分振蕩?/p>

1.2.3 不同鹽度下5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果比較 將高鹽度鹵水過(guò)濾后加入蒸餾水并高壓滅菌，配制成鹽度分別為0、1%、2%、3%、4%的無(wú)菌水，將Mueller-Hinton培養(yǎng)基粉末溶于不同鹽度的無(wú)菌水中，倒入玻璃培養(yǎng)皿制備成固體培養(yǎng)基。采用牛津杯法（管碟法）[20]測(cè)定5種中草藥在不同鹽度（0、1%、2%、3%、4%）下對(duì)2種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）。吸取100 μL菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿等間距放置3個(gè)牛津杯，輕壓使其與培養(yǎng)基緊密接觸。向牛津杯中加200 μL藥液，28 ℃ 培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 不同鹽度下5種中草藥對(duì)愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度的測(cè)定 用二倍稀釋法，將中草藥液稀釋為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。吸取各濃度中草藥溶液200 μL，加入到不同鹽度培養(yǎng)皿的牛津杯中，作為藥物濃度梯度組。加藥完畢后于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng) 24 h 后，觀察結(jié)果，以牛津杯周圍透亮有抑菌圈表示細(xì)菌不生長(zhǎng)（-），牛津杯周圍模糊不清無(wú)抑菌圈表示有細(xì)菌生長(zhǎng)（+）。能夠抑制細(xì)菌正常生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為5種中草藥對(duì)該種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0做單因素方差分析，差異顯著（P<0.05）的用Duncans法做多重比較，表中數(shù)據(jù)用“平均 值± 標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌圈直徑

由表1可知，鹽度不同時(shí)5種中草藥原液對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌圈直徑差異顯著（P<0.05）;而鹽度相同時(shí)不同中草藥的抑菌效果同樣差異顯著（P<0.05）。其中，黃芩在各個(gè)鹽度條件下對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌效果都較為明顯，抑菌直徑均>19.00 mm，而五倍子和石榴皮對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌效果隨鹽度的增加而增強(qiáng)，五倍子、訶子和黃芩在高鹽度條件下抑菌效果顯著高于其他2種藥物（P<0.05），抑菌圈直徑均>29.00 mm。

2.2 中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑

由表2可知，不同鹽度下5種中草藥原液對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑差異顯著（P<0.05）。其中，烏梅對(duì)于嗜水氣單胞菌的抑菌效果最差，各個(gè)鹽度下的抑菌圈直徑均低于其他中草藥。在鹽度為0時(shí)，5種中草藥對(duì)于嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑都較其他鹽度條件下抑菌圈直徑大，抑菌圈直徑均 >19.00 mm，黃芩和烏梅這2種中草藥在鹽度1%～3%，抑菌強(qiáng)度隨鹽度增加而增強(qiáng)。

2.3 中草藥水提物對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的最小抑菌濃度

由表3可知，5種中草藥水提物在不同鹽度下，藥物濃度越高抑菌效果越好。其中鹽度為4%時(shí)，5種中草藥的MIC較低，均≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而鹽度為1%和2%時(shí)，各中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。

2.4 中草藥水提物對(duì)嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度

由表4可知，5種中草藥水提物在不同鹽度下，藥物濃度越高抑菌效果越好。其中，烏梅和黃芩在高鹽度條件下（鹽度為3%、4%）MIC均≥25 mg/mL，抑菌效果較差，而五倍子、石榴皮和訶子在低鹽度條件下（鹽度為1%、2%）的MIC均≤25 mg/mL，抑菌效果較好，在鹽度為0時(shí)，5種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC均≤25 mg/mL，其抑菌效果明顯強(qiáng)于其他鹽度。

3 討論與結(jié)論

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，在相同鹽度條件下，5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌均有不同程度的抑制作用，其中黃芩和五倍子抑菌作用較強(qiáng)，訶子抑菌作用一般，而烏梅抑菌作用較差。石榴皮對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌效果一般，但對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果特別明顯。李權(quán)生等用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了9種抗生素和10種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌等5種常見(jiàn)水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的抑菌效果，研究表明五倍子抑菌效果最好，黃芩次之[21]。其他研究證明，五倍子對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌[22]和嗜水氣單胞菌[23-24]均具有比較明顯的抑制作用，本試驗(yàn)的結(jié)果與之基本一致，這可能與五倍子的藥性有關(guān)，其富含鞣質(zhì)，能夠凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)，同時(shí)含有多種酶，能夠?qū)Χ喾N細(xì)菌起抑制作用[25];黃芩的主要成分是黃芩苷，它具有非常廣泛的抗菌譜[26]，如對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌以及沙門氏菌均具有十分良好的抑制作用，還具有很好的抗病毒作用[26]。

遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌均可在鹽度0～4%環(huán)境下生長(zhǎng)，故設(shè)定0、1%、2%、3%、4%共5個(gè)鹽度梯度，比較5種中草藥在這5個(gè)鹽度梯度下的抑菌效果。鹽度不同時(shí)，5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果明顯不同。在高鹽度（鹽度為3%、4%）時(shí)，5種中草藥對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌的MIC較低，均 ≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而在低鹽度（鹽度為1%、2%）時(shí)，各個(gè)中草藥的MIC均在 25 mg/mL 及以上，抑菌效果較差;在鹽度為0時(shí)，5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的抑菌作用最弱，而鹽度為4%時(shí)抑菌作用最強(qiáng)。由嗜水氣單胞菌的抑菌效果可以看出，嗜水氣單胞菌在鹽度為0時(shí)，5種中草藥對(duì)其的MIC最低，抑菌效果最好。馬玉和等通過(guò)K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)得5種中草藥對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，結(jié)果是5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌在鹽度為4%時(shí)抑菌效果最強(qiáng)，對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果在鹽度為0時(shí)最好[6]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與之基本一致，這可能與不同鹽度下2種致病菌的活性不同有關(guān)。Ring等的研究表明，當(dāng)北極鮭魚(yú)在海水中養(yǎng)殖時(shí)，乳桿菌數(shù)量下降，而乳酸菌屬細(xì)菌和鏈球菌屬細(xì)菌的數(shù)量保持穩(wěn)定[27];也有可能是因?yàn)橹胁菟幵诓煌}度下的藥性有所變化，關(guān)于這一點(diǎn)目前尚未得到論證，還需進(jìn)一步研究。

五倍子、石榴皮、訶子、黃芩、烏梅對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌均有不同程度的抑菌效果。鹽度影響5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果。高鹽度時(shí)，5種中草藥對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌MIC較低，抑菌效果較好;而低鹽度時(shí)，各個(gè)中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉雙鳳. 遲鈍愛(ài)德華氏菌在水產(chǎn)動(dòng)物中致病性及致病因子的若干研究[J]. 黑龍江水產(chǎn)，2014（1）：35-37.

[2]鄭大海，麥康森. 遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）研究概況[J]. 海洋湖沼通報(bào)，2004（1）：52-59.

[3]張 煒，張文超，朱逢樂(lè). 遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）研究概況[J]. 華商，2008（3）：139，165.

[4]沈錦玉. 嗜水氣單胞菌的研究進(jìn)展[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，27（1）：78-86.

[5]馮守明. 嗜水氣單胞菌對(duì)水生動(dòng)物的致病作用及防治[J]. 天津水產(chǎn)，2002（1）：19-23.

[6]馬玉和，王慶奎，郭永軍，等. 5種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌抑菌效果的比較[J]. 飼料工業(yè)，2014，35（16）：51-54.

[7]閆茂倉(cāng)，陳少波，單樂(lè)州，等. 22味中草藥對(duì)創(chuàng)傷弧菌和燦爛弧菌體外抑菌作用篩選[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2010，3（2）：95-98.

[8]左國(guó)營(yíng)，韓 峻，余 巍，等. 47種中草藥提取物的體外抗菌活性篩選研究[J]. 中國(guó)藥房，2005，16（10）：798-799.

[9]張顯忠，郭愛(ài)軍，李艷玲，等. 中草藥提取物的體外抑菌活性研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006（5）：563-565.

[10]候家玉. 中藥藥理學(xué)[M]. 北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2002：207-208.

[11]袁 婷，鐘學(xué)穩(wěn). 常見(jiàn)中草藥的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（9）：23-25.

[12]李春濤，陳 霞，張其中，等. 100種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究[J]. 淡水漁業(yè)，2012，42（2）：27-34.

[13]單曉楓，郭偉生，陳 暢，等. 嗜水氣單胞菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（5）：90-93.

[14]陳 霞，張其中，李春濤. 50種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：862-865.

[15]趙蓓蓓，趙 晶，王志錚，等. 10種常見(jiàn)中草藥水提物對(duì)嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1的體外抑菌效果研究[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，31（4）：316-320.

[16]張海賓，楊桂芳. 12種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌殺傷能力的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2006，25（1）：16-18.

[17]羅 新，張其中. 42種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 淡水漁業(yè)，2011，41（3）：61-65.

[18]Singh G，Maurya S，Delampasona M P，et al. A comparison of chemical，antioxidant and antimicrobial studies of cinnamon leaf and bark volatile oils，oleoresins and their constituents[J]. Food and Chemical Toxicology，2007，45（9）：1650-1661.

[19]劉冬梅，李 理，楊曉泉，等. 用牛津杯法測(cè)定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（3）：110-111.

[20]劉 健，王海雁，趙淑江. 牛津杯法測(cè)定五倍子對(duì)大黃魚(yú)病原弧菌的體外抑菌活力[J]. 海洋科學(xué)，2009，33（11）：44-47.

[21]李權(quán)生，王榮華，譚 情，等. 幾種常見(jiàn)淡水魚(yú)致病菌的藥敏試驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（19）：254-255，259.

[22]陳言峰，鄒記興. 20種中草藥對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的體外抑菌試驗(yàn)[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2011（5）：110-113.

[23]姜巨峰，王玉佩，李春艷. 5種中草藥提取物對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌效果的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：20067-20069.

[24]曹紅峰，宋靖芳. 中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌ST-3-3抑菌作用的研究[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，13（5）：86-88.

[25]Fang，X U，Pengyu，et al. Inhibitory effects of the 26 kinds of Chinese herbal medicines on salmonella[J]. Medicinal Plant，2013，4（3）：76-78.

[26]宋冬冬. 黃芩的抑菌作用及有效化學(xué)成分探討[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11（5）：77-78.

[27]Ring E，Strm E. Microflora of Arctic charr，Salvelinus alpinus （L.）：gastrointestinal microflora of free-living fish and effect of diet and salinity on intestinal microflora[J]. Aquaculture Research，2008，25（6）：623-629.關(guān)素華，曾慶輝，張曉飛，等. 德式乳酸桿菌對(duì)黃河鯉抗脅迫能力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：166-170.