鄭 彤, 袁敏敏, 花 辰, 周 瑤, 李 磊, 孫政璽, 李 韜

揚州大學農(nóng)學院, 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室; 植物功能基因組學教育部重點實驗室; 江蘇省作物基因組學與分子育種重點實驗室, 江蘇 揚州 225009

胚胎晚期豐富(late embryogenesis abundant，LEA)蛋白是指胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的一系列小分子量蛋白質，最早在棉花種子中被發(fā)現(xiàn)[1,2]。1993年，Dure[3]根據(jù)LEA蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，將LEA蛋白分為6組。其中，來自第三組的LEA3蛋白因其在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要功能而被廣泛研究，其顯著特點是通常存在一段多拷貝的11個氨基酸組成的基元序列(T/AA/TO/EA/TA/TKRQ/EDK/RA/TXE/DQ)，可形成親水的α-螺旋結構，該結構能夠避免干旱脅迫時細胞內(nèi)高濃度離子的積累所引起的損傷，同時也可以防止組織內(nèi)過度失水[4]。

LEA3基因一般伴隨種子成熟而表達，在種子萌發(fā)時很快消失，這是該蛋白在種子發(fā)育過程中的一種特定表達模式[5]。然而，其功能并不止于此，研究還發(fā)現(xiàn)LEA3基因的表達與植物抗逆性密切相關，低溫、干旱及鹽漬等脅迫都可以誘導LEA3基因的表達[6,7]。由于LEA3蛋白與植物抗逆性的關系密切，對于LEA3蛋白的深入研究不僅有利于了解植物抗旱的分子機制，而且可以為研究植物抗旱育種提供新的思路和方法。通過外源轉入LEA3基因到植物或微生物體內(nèi)，可以在一定程度上提高轉基因植株的抗逆性。如將大麥HVA1基因(LEA3蛋白)轉入水稻中，發(fā)現(xiàn)轉基因水稻提高了對高鹽脅迫和水分脅迫的耐受性[8]；將大麥的lea3基因轉入紫花苜蓿中，獲得了耐鹽能力增強的轉基因植株[9]；而通過將大豆PM2基因(LEA3蛋白)轉入酵母細胞中，證明了PM2基因全長的耐鹽功能[10]。上述研究為植物抗性育種提供了良好的基礎。

LEA3蛋白除了在干旱和鹽脅迫下發(fā)揮重要功能，與小麥抗病性也存在一定關聯(lián)。楊高山[11]發(fā)現(xiàn)Wrab17基因(LEA3基因家族)在葉銹菌接種早期呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達，并通過一系列實驗證明Wrab17基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的過敏性反應里發(fā)揮著重要作用。本實驗室前期通過高通量蛋白質組學方法在小麥禾谷鐮刀菌接種的抗感池中也鑒定到1個差異表達基因Wrab17(基因號：TraesCS4B02G332800)，研究結果顯示其可能與赤霉病抗性相關[12]。以此為切入點，本研究基于已公布的中國春參考基因組和轉錄組數(shù)據(jù)對小麥TaLEA3基因家族進行全面鑒定，從基因組水平上解析小麥TaLEA3基因家族的序列特征、染色體分布、進化關系與表達特征，以期為進一步研究該家族成員的功能、探索其與赤霉病抗性之間的關系以及改良小麥赤霉病抗性提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥TaLEA3基因家族的鑒定及序列分析

關于LEA3基因家族的鑒定參照水稻[13]和短柄草[14]的鑒定方法。小麥的中國春參考基因組與轉錄組數(shù)據(jù)在URGI網(wǎng)站(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)下載。通過Pfam蛋白質家族數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)查找并下載LEA3蛋白結構域(PF02987)的隱馬爾可夫模型[15]，利用HMMER 3.0[16]搜索小麥基因組中的TaLEA3基因做為候選基因家族成員，默認參數(shù)取0.01。另外將擬南芥[17]和水稻[13]中已經(jīng)報道的24條LEA3蛋白序列作為模板，通過TBlastn方法比對到小麥基因組上，得到TaLEA3候選基因家族成員。選擇2種方法同時檢測到的候選基因家族成員，利用PFAM(http://pfam.xfam.org/search/sequence)[18]和SMART在線工具(http://smart.embl.de/)進行蛋白質保守結構域的驗證，剔除無典型LEA3結構域的序列，并進行手工確認，最終獲得小麥TaLEA3基因家族所有成員。

利用小麥JBrowse網(wǎng)站(http://202.194.139.32/)和ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)獲得該家族成員蛋白質的相關信息，如染色體位置(position)、外顯子數(shù)目(exon)、理論分子質量(Mw)、等電點(pI)、總平均親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)等；采用PSORT(http://psort1.hgc.jp/form.html)[19]預測LEA3蛋白的亞細胞定位信息。

1.2 基因復制事件及選擇壓力分析

染色體大片段復制和串聯(lián)重復是家族基因擴張的主要模式。為了研究小麥TaLEA3基因家族的復制事件，通過TBtools軟件[20]作圖將各基因物理位置信息定位到不同染色體上，并利用MCScans軟件[21]分析基因的復制事件，隨后將小麥TaLEA3基因家族的共線性關系進行可視化分析。

達爾文進化選擇的類型通常通過計算Ka/Ks[22](非同義替換率/同義替換率)來衡量，其中Ka/Ks=1用于中性選擇；Ka/Ks<1表示純化選擇；Ka/Ks>1表示正向選擇。利用ClustalX2軟件對TaLEA3家族的編碼區(qū)(coding DNA sequence，CDS)序列進行多重序列比對，并通過DnaSP6軟件計算核苷酸的同義替換率Ks、非同義替換率Ka以及兩者的比值。

1.3 小麥TaLEA3基因家族成員的系統(tǒng)進化樹構建

為了充分揭示小麥TaLEA3家族基因的進化關系，利用5個物種的LEA3家族蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。除小麥外，還選用了擬南芥[17](6個)、水稻[13](5個)、短柄草[14](4個)和大豆[23](6個)中已報道的LEA3家族蛋白(共21個)構建進化樹，利用MEGA 7.0軟件[24]中的最大似然法(M-L)構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap設置為1 000。隨后用Evolview在線工具[25]進行美化。相關基因的序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)下載。

1.4 小麥TaLEA3基因結構及啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件分析

小麥TaLEA3家族基因的外顯子-內(nèi)含子結構可通過將其CDS序列與其對應的基因組序列進行比較，得到相應的外顯子、內(nèi)含子、染色體位置等信息；基于MEME在線工具[26]對該家族motif序列進行分析，優(yōu)化參數(shù)如下：限制最多挖掘到的motif數(shù)目為10個，每個motif的最佳寬度在6～100個殘基之間。為了進一步研究小麥TaLEA3家族基因可能參與的調(diào)控類型，選取小麥TaLEA3家族基因上游2 kb區(qū)域，利用PlantCare網(wǎng)站[27]進行順式作用元件預測，篩選出可能與赤霉病抗性調(diào)控相關的元件。最后，將以上3組結果輸入TBtools軟件[20]進行可視化繪圖。

1.5 小麥TaLEA3基因家族成員的表達譜分析

干旱高溫脅迫下的基因表達結果來自于2015年Liu等[28]已發(fā)表的小麥轉錄組數(shù)據(jù)，實驗材料為美國堪薩斯州小麥品種TAM107，對小麥幼苗分別進行1 h和6 h的高溫脅迫(40℃)及干旱處理(20% (m/V) PEG-6000)，對照組(CK)在室溫條件下采用等量的水做相同處理，一共6組實驗，每組2個重復，取葉片提取RNA進行轉錄組測序。赤霉菌接種下的基因表達情況則來自于2016年Gou等[29]已發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)，實驗材料為小麥中國春(CS)和CS-7EL代換系，其中中國春為赤霉病感病材料，CS-7EL為赤霉病抗病代換系，通過單花滴注法接種赤霉菌Fg65菌株，實驗分為2組，每組3個重復，接種后4 d取穗軸提取RNA進行轉錄組測序。

為了驗證4B染色體上TaG3LEA-25基因轉錄水平的表達情況，采用SYBR Premix ExTaq(日本TaKaRa公司)進行qRT-PCR實驗。實驗材料為1個赤霉病抗病池(包含F(xiàn)hb1抗病近等基因系NIL-R、蘇麥3號、望水白、Nyubai、寧7840、黃方柱、白三月黃、黃蠶豆、臺灣小麥和Tokai-66共10個材料)和1個赤霉病感病池(包含F(xiàn)hb1感病近等基因系NIL-S、Wheaton、Bobwhite、Jagger、中國春和Clark共6個材料)。對這16個抗感品系分別選取10個小穗采用單花滴注法接種10 μL的禾谷鐮刀菌孢子懸浮液，對照組接種10 μL綠豆湯懸浮液(采用同樣的方法)，共得到4個集合，分別是抗池接種(RFg)、抗池對照(RM)、感池接種(SFg)、感池對照(SM)。在接種3 d后分別取4個集合中的接種小穗穗軸部位，等量混合并提取RNA，使用TRIzol reagent試劑盒分離并純化總RNA，隨后使用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒(日本Takara公司)逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR實驗。反應體系(20 μL)：cDNA 1 μL，正、反向引物各0.8 μL，50×ROXⅡ 0.4 μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，滅菌水 7 μL。反應程序如下：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共40個循環(huán)?？醇一騎aActing與TaG3LEA-25的引物序列如表1所示。本次qRT-PCR每個樣本池包含3個生物學重復和3個技術重復，每個基因的相對表達量使用2-ΔΔCT公式計算。相對表達量使用SPSS 23軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小麥中TaLEA3基因家族成員獲得

根據(jù)HMMER 3.0軟件在小麥中的搜索結果，找到36條蛋白質序列作為候選基因家族成員，隨后，將擬南芥(18條)和水稻(6條)中已鑒定到的LEA3家族成員與小麥蛋白質組做TBlastn比對后，共得到59條同源序列作為候選基因家族成員。整理合并后發(fā)現(xiàn)HMMER方法找到的候選基因家族成員全部存在于TBlastn得到的序列中，因此可將其直接作為分析對象進行結構域的驗證。通過PFAM和SMART在線工具進行保守結構域分析，手工矯正并剔除了10條不包含完整LEA3特征結構域的序列，最終留下26條序列作為小麥TaLEA3基因家族成員，以其在染色體上的位置順序命名為TaG3LEA-1～TaG3LEA-26。

表1 TaActing與TaG3LEA-25的引物序列Table 1 Primer sequences of TaActing and TaG3LEA-25.

對該基因家族蛋白質進行序列及理化性質分析，結果如表2所示，小麥TaLEA3家族中，最長的有408個氨基酸殘基(TaG3LEA-19)，最短的有163個氨基酸殘基(TaG3LEA-13)；外顯子數(shù)目大多為2～3個；蛋白質的相對分子質量為16.9～43.2 kDa，大部分在10～30 kDa；總平均親水性在-0.633～-1.118之間，可以看出小麥中的LEA3蛋白均具有較高的親水性，符合其家族特質。蛋白質亞細胞定位結果顯示，21個TaLEA3蛋白被預測定位在細胞質中，2個TaLEA3蛋白被同時定位在細胞質和線粒體基質中，3個位于4A、4B、4D上的TaLEA3蛋白被單獨定位在線粒體基質內(nèi)。

表2 26個小麥TaLEA3基因家族成員基本信息Table 2 The basic information of 26 TaLEA3 genes in wheat.

注：C：細胞質(cytoplasm)；MM：線粒體基質(mitochondrial matrix)。

2.2 小麥TaLEA3家族基因復制事件及選擇壓力分析

小麥TaLEA3家族基因分布于小麥21條染色體中的9條染色體上(圖1)，分別是1A、1B、1D、3A、3B、3D、4A、4B和4D。其中1A、1B、1D上含有較多的基因(5～6個)。根據(jù)Holub[30]的描述，1個染色體在200 kb以內(nèi)的區(qū)域包含2個或者更多的基因，則被定義為串聯(lián)復制事件。由此可以看出，該家族在1A、1B和1D染色體的長臂端聚集成3個串聯(lián)重復的區(qū)域，表現(xiàn)為TaLEA3家族基因分布的熱點區(qū)域。除了串聯(lián)重復事件外，通過MCScanX方法進行共線性分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)還存在12個片段復制事件，涉及該家族的15個基因。一些基因被發(fā)現(xiàn)至少與3個同源基因對有關，其中1A染色體上的TaG3LEA-2基因與TaG3LEA-6、TaG3LEA-12和TaG3LEA-20均存在片段復制現(xiàn)象；3A染色體上的TaG3LEA-18基因與TaG3LEA-6、TaG3LEA-16、TaG3LEA-20和TaG3LEA-22也存在片段復制現(xiàn)象，推測這些基因可能在TaLEA3基因家族進化過程中發(fā)揮了重要作用；4A、4B、4D染色體上的TaG3LEA-23、TaG3LEA-24和TaG3LEA-26這3個基因經(jīng)過相互片段復制產(chǎn)生，且與其他染色體上基因無關，說明這3個基因可能在祖先分化之前就已經(jīng)存在。

同義替換(synonymous substitution)和非同義替換(nonsynonymous substitution)是生物進化過程中核苷酸替換的2種形式，Ka、Ks及Ka/Ks能反映出基因進化過程中受到的選擇壓力。為了更好地理解作用于TaLEA3基因家族進化的制約因素，本研究也對該家族各基因進行了選擇壓力分析。如圖3所示，該家族在1A、1B、1D、3A、3B、3D上的基因之間Ka/Ks均小于或等于1，趨向于純化選擇或者中性選擇，說明這些基因在進化過程中序列并未發(fā)生太大改變，相似性較高；而TaG3LEA-23和TaG3LEA-26與這6條染色體上基因之間的選擇壓力幾乎都大于1，說明這2個基因可能經(jīng)歷了較強的正向選擇壓力，序列變異明顯。4B染色體上的TaG3LEA-24基因與1A、1B、1D、3A、3B、3D這6條染色體上的基因間多為中性選擇，與TaG3LEA-23和TaG3LEA-26這2個基因呈正向選擇，結合之前的復制事件分析可以推測，TaG3LEA-24基因可能是TaG3LEA-23和TaG3LEA-26這2個基因的祖先，隨后經(jīng)歷了一系列的正向選擇分化得到。此外，4B染色體上的TaG3LEA-25基因是一個特殊例子，該基因與其他各基因之間均是純化-中性選擇的關系，可能具有某些重要意義。

圖1 小麥TaLEA3家族基因的染色體分布Fig.1 Chromosome distribution of TaLEA3 gene family in wheat.注：基因名加背景色的表示串聯(lián)重復，左側標尺表示物理距離(Mb)。

圖2 小麥TaLEA3家族基因的共線性關系Fig.2 Synteny analysis of TaLEA3 gene family in wheat.注：染色體間的線條表示片段復制。

圖3 小麥TaLEA3基因家族選擇壓力分析Fig.3 Selection pressure analysis of TaLEA3 gene family in wheat.

2.3 小麥與不同物種LEA3基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)序列的相似性，采用M-L法對5個物種的LEA3基因家族進行進化分析，結果如圖4所示。系統(tǒng)進化可以分為3個簇，其中Cluster3中的蛋白總數(shù)占總體的56.5%，并且大部分的小麥TaLEA3家族基因都聚類在這個簇中，同時，1個擬南芥基因、2個水稻基因和1個二穗短柄草基因也在這個簇中，說明這些基因之間可能具有相似的功能。此外，有5個基因(TaG3LEA-17、TaG3LEA-19、TaG3LEA-21、TaG3LEA-23、TaG3LEA-24和TaG3LEA-26)被聚類在Cluster2中，且5個物種的基因在Cluster2中均有分布。Cluster1中不含小麥TaLEA3家族的基因，說明小麥中TaLEA3家族與Cluster1中的基因在序列上存在較大的差異。值得說明的是，二穗短柄草作為與小麥親緣關系非常相近的物種，其LEA3家族與小麥TaLEA3家族也具有相當高的相似性。

2.4 小麥TaLEA3家族基因結構及啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件分析

通過TBtools軟件對小麥TaLEA3家族系統(tǒng)進化樹、基因結構及motif序列分析進行可視化繪

圖4 無根系統(tǒng)發(fā)育樹代表小麥TaLEA3家族與擬南芥、短柄草、水稻、大豆LEA3家族間的關系Fig.4 Phylogenetic tree representing relationships among LEA3 genes from Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, rice and soybean.注：不同背景色表示分成3個不同的簇。■表示小麥，▲表示擬南芥，★表示水稻，●表示短柄草，√表示大豆。

圖后，結果如圖5所示。由基因結構可知(圖5C)，小麥TaLEA3家族基因結構相對簡單，大部分基因都含有2～3個外顯子，3B上的TaG3LEA-20基因含有4個外顯子，1B上的TaG3LEA-9基因比較特殊，含有6個外顯子，基因長度則達到6 kb。LEA_4結構域存在于該基因家族的外顯子上，長度在30～50個氨基酸殘基左右，有些基因則含有多個LEA_4結構域，并且串聯(lián)形成簇。在TaLEA3家族基因的結構域中還發(fā)現(xiàn)了PTZ00121這一結構域，很多LEA_4結構域存在于PTZ00121結構域內(nèi)，其氨基酸組成上可能與LEA_4結構域存在一定相似性。

Motif是蛋白質分子具有特定功能或作為獨立結構域一部分的二級結構聚合體?；蚣易逯懈鞒蓡T的公共motif可能是該家族執(zhí)行重要功能或組成結構上不可缺少的一部分。通過挖掘基因家族各成員蛋白質中的motif信息，可以作為識別該基因家族的特征，并且解釋其響應的功能。本研究共挖掘了TaLEA3基因家族蛋白質的10個motif，結果如圖5B所示，大部分TaLEA3家族基因都含motif 2、motif 5或者兩者的結合。而從這2個motif內(nèi)部序列分析結果(圖6)可知，motif 2與motif 5均含有典型的LEA3基因家族11個氨基酸殘基組成的基元序列，是鑒定該基因家族的重要依據(jù)。另外，位于第3支(紅色)(圖5A)的該家族蛋白質具有與其他組不同的motif組成，比如在N端丟失了motif 3，而獲得了motif 6和motif 9等；在C端丟失了motif 4和motif 10，獲得了motif 7和motif 8。與系統(tǒng)進化樹分類結果(圖5A)有所不同的是，TaLEA3家族基因根據(jù)motif元件類型可以明顯分成2組，黃色和藍色類型可以被歸為一組，因為它們具有相似的motif組成。

圖5 小麥TaLEA3基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結構及保守蛋白motifFig.5 Phylogenetic relationships, gene structure and architecture of conserved protein motifs in TaLEA3 gene family from wheat.注：A：利用MEGA 7.0軟件構建的小麥LEA3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，詳細分支用不同顏色顯示。B：小麥TaLEA3基因motif組成，選擇挖掘10個motif，不同的motif用不同的顏色。蛋白質的長度可以用底部標尺來衡量。C：小麥TaLEA3基因外顯子結構，綠色代表5′-3′區(qū)域，黃色代表外顯子，黑線表示內(nèi)含子。TaLEA3基因家族結構域存在于粉紅色和墨綠色方塊中，略有重疊。最下側標尺表示基因長度(bp)。

圖6 小麥LEA3蛋白的motif 2(上)及motif 5(下)結構域序列Fig.6 The LEA3 protein sequence of motif 2 (upper panel) and motif 5 (lower panel) domain in wheat.

順式作用元件(cis-acting element)是存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，包括啟動子、增強子、調(diào)控元件等，其作用是參與基因表達的調(diào)控。通過選取CDS序列上游2 kb啟動子區(qū)域，挖掘TaLEA3家族基因在啟動子區(qū)域存在的順式作用元件，對于了解該基因家族的功能具有推動作用。本研究對啟動子區(qū)域進行篩選，留下一些可能與赤霉病抗性相關的順式作用元件(圖7)，每個基因中都含有與脫落酸(abscisic acid，ABA)響應相關的元件。在以往的研究中，有報道通過接種禾谷鐮刀菌與ABA的混合液可以促進相關基因的表達[31]。本研究還挖掘到了一些與茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水楊酸(salicylic acid，SA)相關的調(diào)控元件。也有報道顯示JA[32]和SA[33]與赤霉病抗病性相關。此外，與干旱、低溫以及逆境壓力防御相關的調(diào)控元件也被發(fā)現(xiàn)，該結果說明TaLEA3家族與植物的逆境脅迫應答有較強的關聯(lián)。

圖7 小麥TaLEA3基因家族CDS序列上游2 kb啟動子區(qū)域的順式調(diào)控元件分布Fig.7 Cis-regulatory element distribution in 2 kb promoter region upstream of CDS sequence of wheat TaLEA3 gene family.

2.5 小麥TaLEA3家族基因的表達譜分析

利用公共的轉錄組數(shù)據(jù)進行小麥TaLEA3家族基因表達分析，在干旱(20% (m/V) PEG-6000)和高溫(40℃)脅迫下的表達情況如圖8A所示。結果表明，26個小麥TaLEA3基因家族成員中，并非所有基因都能對干旱和高溫脅迫產(chǎn)生響應，僅TaG3LEA-1、TaG3LEA-2、TaG3LEA-6、TaG3LEA-13、TaG3LEA-22和TaG3LEA-25這6個基因對干旱表現(xiàn)較為敏感，在干旱脅迫下，呈現(xiàn)差異表達且隨時間推移(1～6 h)表達量明顯升高。除TaG3LEA-25外，其他基因對高溫的響應都不敏感，表達量均無明顯變化，即便在干旱和高溫的同時作用下，各基因的表達量均無升高，推測高溫對于TaLEA3家族基因的表達可能具有一定抑制作用。值得注意的是，該家族所有基因中，TaG3LEA-25在對照(CK)及各個處理下的表達都很高，并且在處理時間內(nèi)隨時間增加表達量明顯提升。

在接種赤霉菌條件下TaLEA3家族基因的表達情況如圖8B所示，對感病材料中國春以及抗病的中國春7EL代換系(CS-7EL)幼苗進行接種后4 d穗軸部位基因表達量分析結果表明，TaG3LEA-25這一基因在小麥發(fā)育早期表達量較高，并且其在抗病材料CS-7EL的表達量(TPM值33.41)明顯高于感病材料中國春(TPM值10.42)，暗示著TaG3LEA-25可能是一個與赤霉病抗病性相關的基因，其余基因表達無明顯差異。

基于基因表達熱圖，選擇TaG3LEA-25基因作為研究對象，通過構建1個抗病池和1個感病池，分別進行赤霉菌接種和綠豆湯接種(對照)，隨后進行qRT-PCR基因表達量分析，結果如圖9所示，在赤霉菌接種后3 d，TaG3LEA-25在不同抗、感池的處理下穗軸部位的響應是不同的。該基因在對照接種的抗病池和感病池相對表達量差異不大，說明在未接種條件下其在各材料中均有表達；而在對抗病池進行接種后(RFg)，其相對表達量為1.548，單因素方差分析結果P值為0.005 9(即P<0.01)，說明相較于對照接種的抗病池(RM)其表達量呈極顯著上調(diào)。在對感病池進行接種后，其相對表達量僅為0.616，表明在赤霉菌接種后其相對表達量極顯著下調(diào)。以上結果與熱圖中結果一致，說明TaG3LEA-25基因可能參與赤霉病抗病相關的表達。綜合上述分析，qRT-PCR結果與RNA-seq數(shù)據(jù)在趨勢上基本一致，也證明了使用RNA-seq數(shù)據(jù)評估小麥在不同處理下的轉錄表達水平是合理可行的。

圖8 小麥TaLEA3家族基因在干旱和高溫脅迫下(A)及在接種赤霉菌接種下(B)的表達譜Fig.8 Expression profiles of the wheat TaLEA3 gene family under drought and heat stress (A) and Fusarium graminearum inoculation (B).

圖9 通過qRT-PCR分析TaG3LEA-25基因在赤霉病壓力脅迫下的表達情況Fig.9 qRT-PCR analysis of TaG3LEA-25 gene in response to FHB treatment.注：數(shù)據(jù)通過TaActin基因校準，誤差棒表示標準差。RFg上的**表示與RM相比差異極顯著;SFg上的**表示與SM相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

LEA3蛋白早在1993年就有研究[34]，且被證實與生物抗逆性密切相關[35]。近年來，對于LEA3蛋白的研究已經(jīng)深入到各大植物中，已分離的LEA3基因主要有小麥WRAB19基因[36]、Wrab17基因[37]、TaLEA3基因[38]，大麥HVA1基因[39]，水稻OsLEA3基因[40]，玉米ZMLEA3基因[41]，大豆PM2基因[42]等，均涉及到對干旱、低溫等逆境的響應。迄今為止，LEA3家族成員已在水稻[13]、擬南芥[17]、大豆[23]及二穗短柄草[14]等植物中得到了系統(tǒng)的鑒定，但是在小麥中還未見相關報道。隨著小麥參考基因組數(shù)據(jù)的公布，從全基因組水平鑒定這一基因家族成為可能。本研究基于已公布的小麥參考基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，運用生物信息學手段對小麥TaLEA3基因家族進行了綜合分析和相關驗證。

LEA3基因在小麥中包含一個大的家族，通過HMMER 3.0搜索和TBlastn這兩種方法分別進行全基因組鑒定，確定了26個基因為該基因家族成員，確保了鑒定的全面性和準確性。該家族基因的分布集中在1A、1B、1D、3A、3B、3D、4A、4B和4D 9條染色體上，呈現(xiàn)出多拷貝的分布特征。染色體分布顯示，在1A、1B和1D染色體上各存在1個串聯(lián)重復區(qū)塊，涉及14個基因，這種基因組中的串聯(lián)復制(segmental duplication, SD)導致數(shù)量上的擴增，也間接證明了LEA3基因在進化過程中的擴張。除了串聯(lián)重復，還存在片段復制(tandem duplication，TD)的現(xiàn)象，共線性分析結果發(fā)現(xiàn)12對旁系同源基因由片段復制產(chǎn)生，涉及15個基因，占該家族總基因的57.7%，說明該家族大部分基因是通過染色體的復制、加倍事件持續(xù)擴張的，最早可能起源于1A、1B和1D染色體。達爾文選擇壓力分析也證實，位于1A、1B、1D與3A、3B、3D上的基因相互之間大都趨向于純化選擇或中性選擇，其序列未發(fā)生較大變異；3A、3B、3D上的基因相互之間開始發(fā)生了一些正向選擇；而4A、4B、4D上的基因(除TaG3LEA-25外)在其內(nèi)部為純化至中性選擇，與其他染色體上的基因則均為正向選擇，發(fā)生較大變異，推測TaG3LEA-25基因可能作為銜接這些染色體上基因之間的紐帶而發(fā)揮一定的功能。

相當多的證據(jù)表明LEA3基因在植物生長發(fā)育過程中對非生物脅迫耐受性具有重要作用，比如冷和干旱等[10,35,43]。根據(jù)小麥中LEA3基因在干旱和高溫脅迫下以及在赤霉菌接種下的表達結果發(fā)現(xiàn)，TaG3LEA-25這一基因在各條件下都顯著表達，說明該基因與小麥抵抗逆境有關，并且發(fā)揮著相當重要的功能。RT-qPCR的驗證結果也顯示，TaG3LEA-25基因可能是一個與赤霉病抗病相關的基因，在抗病品系接種赤霉菌的條件下呈現(xiàn)出較高的表達。

本研究通過結合同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育和基因表達，比較系統(tǒng)地分析了小麥TaLEA3基因家族的序列組成和特征，為更好理解小麥TaLEA3家族基因的生物學功能提供了寶貴資源。這種綜合分析有利于選擇候選LEA3基因進行進一步的功能鑒定，為小麥抗赤霉病抗性遺傳改良提供更多選擇。