馬曉凈, 趙斌斌, 劉 揚(yáng), 馬夢迪, 王海洋

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京100081; 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642

對于植物而言，光是重要的能量來源及環(huán)境信號，幾乎貫穿于植物的一生，對于植物的生長發(fā)育極其重要[1]。植物主要依靠四類光受體感知光的變化，其中以紅光(R)及遠(yuǎn)紅光(FR)(600～750 nm)受體——光敏色素(phytochromes, phys)的研究最為透徹。光敏色素是含有一個線性四吡咯發(fā)色團(tuán)的同源二聚體，單體約120 kDa[2]。phyB在植物體內(nèi)以兩種可逆狀態(tài)存在，即有活性的FR吸收態(tài)——Pfr和非活性的R吸收態(tài)——Pr[3]。其通過與光敏色素互作因子(phytochrome interacting factors, PIFs)互作來行使其功能[4～7]。Nito等[8]認(rèn)為將擬南芥PHYB的104位酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可使其對紅光超敏感。Zhang等[9]研究表明，將擬南芥PHYB N端361位的酪氨酸(Y)殘基突變?yōu)楸奖彼?F)殘基可增強(qiáng)其活性。

同時，光敏色素B還是避蔭反應(yīng)的抑制因子[10]。避蔭反應(yīng)是一個十分復(fù)雜的過程[11～12]，通常認(rèn)為紅光與遠(yuǎn)紅光的比例(R:FR)下降是觸發(fā)避蔭反應(yīng)的因素。密植后(遮陰)植物之間相互遮擋，由于植物葉片對有效光的截留、吸收及反射等影響導(dǎo)致底層紅光與遠(yuǎn)紅光比例下降(低R:FR)，而影響植物的光合作用。在低R:FR生長條件下，擬南芥表現(xiàn)為莖和葉柄伸長、葉片上翹、葉面積變小、分枝減少、早花、根系弱、易感病、抗逆性減弱等適應(yīng)性特征，這些反應(yīng)統(tǒng)稱為避蔭反應(yīng)(shade avoidance response, SAR)[13～15]。

在低R:FR生長條件下，單子葉植物也會出現(xiàn)莖稈徒長、分蘗顯著減少、產(chǎn)量下降、易倒伏、雌雄間隔增大等特征。并且玉米中的phyB1phyB2雙突變體和高粱中的phyB突變體與擬南芥中的phyB突變體類似，均表現(xiàn)出避蔭反應(yīng)的特征，如植株增高、節(jié)間增長、易倒伏、分蘗減少、早花等[16～19]。這一結(jié)果表明，phyB也是禾本科植物中調(diào)控避蔭反應(yīng)的主要光受體[20]。目前擬南芥中遮蔭反應(yīng)分子機(jī)理的研究已經(jīng)相當(dāng)完善，但在禾本科植物中的研究還十分有限[19]。因此研究玉米的光敏色素B對于了解玉米避蔭反應(yīng)及光敏色素在單、雙子葉植物避蔭反應(yīng)中的功能差異十分重要。

玉米(ZeamaysL.)由于廣適性、高產(chǎn)、用途多樣等特點(diǎn)，在全球范圍內(nèi)被廣泛種植。2012年玉米已成為我國第一大谷物。研究表明[21]，我國玉米單產(chǎn)水平與美國等國家相去甚遠(yuǎn)。Duvick等[22]研究發(fā)現(xiàn)增加單位面積玉米的種植密度以增加果穗數(shù)是提高玉米單產(chǎn)的有效途徑，但目前我國玉米的種植密度僅為美國的60%左右。因此，我國在玉米種植密度上還有很大的提升空間。但在高密度種植情況下，避蔭反應(yīng)綜合征是限制玉米產(chǎn)量提高的主要因素，因此解析避蔭反應(yīng)關(guān)鍵基因光敏色素的功能，對于深入了解玉米光信號遺傳網(wǎng)絡(luò)、指導(dǎo)玉米新品種培育具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 玉米自交系B73、擬南芥野生型Col-0、擬南芥突變體phyB-9、本生煙草(N.benthamiana)為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、P19菌株、AT-Hook菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存；改造后的pCAMBIA載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105-03)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106-02)、通用型DNA純化回收試劑盒(DP214-03)、熒光定量試劑盒(FP205-02)購于天根生化科技公司；Trizol試劑盒購于賽默飛世爾試劑公司；限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa公司和NEB公司；In-fusion HD Cloning Kit購于Clontech公司；KOD Fx PCR擴(kuò)增酶購于ToYoBo公司等。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 TC-XP型PCR儀購于廣州博日科技公司；Quant Studio 3實(shí)時定量PCR儀購于ABI公司；Tanon-100一體化凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能公司；低溫離心機(jī)購于Eppendorf公司；NANO DROP 2000C購于Thermo公司；三色光植物培養(yǎng)箱購于PERCIVA公司；Stemi 508型體視顯微鏡購于蔡司公司；LB985型植物活體成像儀購于Berthold Technologies公司等。

1.2 方法

1.2.1序列獲得 在Tair數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)和MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org/)中下載擬南芥及玉米光敏色素蛋白質(zhì)序列。

1.2.2組織表達(dá)分析 利用Trizol法提取RNA；反轉(zhuǎn)錄(詳見天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR106-02)說明書)；轉(zhuǎn)基因株系中外源基因ZmPHYB1的表達(dá)量檢測利用引物qPHYB1-F/R(表1)，內(nèi)參引物參考Liu等[23]的引物序列，進(jìn)行實(shí)時定量PCR(操作詳見天根熒光定量試劑盒(FP205-02)說明書)。

1.2.3ZmPHYB1序列的克隆及改造 利用CTAB法[24]提取DNA，RNA提取同1.2.2。在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org/)中檢索PHYB1(GRMZM2G124532)基因并下載其序列信息，設(shè)計克隆及位點(diǎn)改造所需的引物(引物序列見表1)。ZmPHYB1啟動子(pZmPHYB1)由引物ZmPHYB1-pro-F/ZmPHYB1-pro-R以自交系B73基因組DNA為模板進(jìn)行克隆；野生型ZmPHYB1(ZmPHYB1WT)編碼序列(CDS)由引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R以自交系B73的cDNA為模板克隆。為了得到序列ZmPHYB1Y98F，ZmPHYB1Y359F(兩個位點(diǎn)的確定詳見2.1)，通過重疊PCR的方法進(jìn)行克隆。具體操作如下：以ZmPHYB1WT為模板，利用引物ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-98-R和ZmPHYB1-98-F/ZmPHYB1-R，分別進(jìn)行富集，純化回收，混合后作為模板。再以ZmPHYB1-F/ZmPHYB1-R進(jìn)行重疊PCR，獲得ZmPHYB1Y98F；以同樣的方法獲得ZmPHYB1Y359F。

1.2.4轉(zhuǎn)基因及鑒定 將pZmPHYB1與ZmPHYB1WT、ZmPHYB1Y98F及ZmPHYB1Y359F分別融合，與改造后的pCAMBIA載體重組獲得重組子。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥中研究其功能。轉(zhuǎn)基因采用擬南芥花序浸染法[25]；轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定采用噴灑Basta篩選法及特異引物PCR檢測法。特異引物PCR檢測法具體操作如下，提取轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA為模板，以鑒定引物ZmPHYB1-identify-FP/RP(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若為陽性植株則可見1.4 kb大小條帶，陰性植株則無此條帶。

1.2.5表型統(tǒng)計及分析 主要觀測的表型包括下胚軸長度、葉柄長度、葉片長度等。每個材料取30株進(jìn)行表型的測量及統(tǒng)計，采用t測驗(yàn)(Student’sttest)進(jìn)行顯著性分析。下胚軸長度測量：人工氣候室(光照/黑暗:16 h/8 h)培養(yǎng)6～7 d后，體視顯微鏡下觀察、拍照；用Image J軟件測量30株幼苗的下胚軸，統(tǒng)計分析；葉柄長度及葉片長度測量：取在長日照條件下生長2～3周材料的第3、4片葉，相機(jī)拍照；Image J軟件測量30個單株的葉柄長度及葉片長度，統(tǒng)計分析。

1.2.6蛋白互作研究 采用熒光素酶互補(bǔ)成像(firefly luciferase complementation imaging assay, LCI)實(shí)驗(yàn)[23]進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers for the study.

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米PHYB1改造位點(diǎn)的確定

已有研究發(fā)現(xiàn)，把擬南芥PHYB的104位與361位的酪氨酸(Y)殘基改造為苯丙氨酸(F)殘基可以提高擬南芥phyB的活性[8,9]。下載擬南芥、玉米、水稻、大豆、高粱等的PHYB全蛋白序列進(jìn)行比對。結(jié)果如圖1所示，通過序列比對，我們發(fā)現(xiàn)在以上物種中，這兩個位點(diǎn)十分保守。最終我們確定玉米中的98位和359位酪氨酸(Y)殘基分別與擬南芥中104位和361位酪氨酸(Y)殘基相對應(yīng)。

圖1 氨基酸突變位點(diǎn)Fig.1 Amino acid mutation sites.ZmPHYB1：玉米PHYB1；SbPHYB：高粱PHYB；ZmPHYB2:玉米PHYB2；OsPHYB：水稻PHYB；AtPHYB：擬南芥PHYB；GmPHYB：大豆PHYB。

2.2 轉(zhuǎn)基因單拷貝純合株系的篩選

將構(gòu)建好的pZmPHYB1∷ZmPHYB1WT，pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y98F和pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y359F三種重組子分別轉(zhuǎn)入擬南芥phyB-9突變體中。采用噴灑Basta溶液的方法，篩選陽性植株。最終得到單基因插入的純合轉(zhuǎn)基因植株，收取種子待用。為了確定轉(zhuǎn)基因純合株系的真實(shí)性，對以上植株進(jìn)行PCR鑒定。陽性轉(zhuǎn)基因植株可見

1.4 kb的條帶，而野生型(Col-0)及phyB-9無該條帶，如圖2。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們最終得到了確切的單基因插入的轉(zhuǎn)基因純合株系。

圖2 PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因株系Fig.2 PCR identification of positive lines.

2.3 表達(dá)分析

為了得到ZmPHYB1基因的表達(dá)圖譜，在線搜索了ZmPHYB1的RNA-Seq數(shù)據(jù)[26]，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3A所示；同時針對2.2中得到的純合轉(zhuǎn)基因株系我們還進(jìn)行了外源基因ZmPHYB1的實(shí)時定量PCR檢測，結(jié)果如圖3B所示。通過以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmPHYB1基因在根、莖(節(jié)間)、葉、頂端分生組織(SAM)、雄穗、花絲等組織中均有表達(dá)，但主要在葉子中表達(dá)，尤其是在V9時期的第13片葉及未成熟葉片中表達(dá)量最高。此結(jié)果與光敏色素基因光受體的功能相符。由圖3B還可以發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因株系中，轉(zhuǎn)入的外源ZmPHYB1可在phyB-9突變體中表達(dá)。

圖3 ZmPHYB1基因的表達(dá)情況 Fig.3 The expression of ZmPHYB1.A.ZmPHYB1基因在玉米不同組織中的表達(dá)情況；B.擬南芥各轉(zhuǎn)基因株系中ZmPHYB1的表達(dá)水平。WT#1/2、Y98F#16/24、Y359F#3/12名稱中“#”后面的數(shù)字表示轉(zhuǎn)基因株系編號。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型分析

2.4.1轉(zhuǎn)基因株系下胚軸長度統(tǒng)計分析 如圖4A所示，phyB-9突變體的下胚軸顯著長于各轉(zhuǎn)基因株系及野生型。圖4B中統(tǒng)計數(shù)據(jù)也同樣證實(shí)上述結(jié)果。對以上結(jié)果進(jìn)行分析可以得出：①轉(zhuǎn)入外源基因ZmPHYB1可以使phyB-9突變體的下胚軸長度部分或完全恢復(fù)到野生型水平，即抑制突變體下胚軸伸長；②經(jīng)過位點(diǎn)改造的轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸短于未經(jīng)過位點(diǎn)改造的轉(zhuǎn)基因株系。綜上所述，ZmPHYB1與擬南芥中phyB具有相似的功能。并且Y98F和Y359F氨基酸的替換可增強(qiáng)ZmPHYB1的活性，此結(jié)果與前人在擬南芥中的研究相符[8]。

圖4 轉(zhuǎn)基因株系表型Fig.4 Phenotype of transgenic lines.注：A.長日照條件下生長6天的植株的表型；B.長日照條件下生長兩周的葉片形態(tài)；C.長日照條件下，下胚軸長度的測量及統(tǒng)計；D.長日照條件下，第三、四片真葉葉片長度的測量及統(tǒng)計；E.長日照條件下，第三、四片真葉葉柄長度的測量及統(tǒng)計。標(biāo)尺為1 mm；**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.01水平上差異顯著(t檢驗(yàn)，n=30)。

2.4.2轉(zhuǎn)基因株系葉片長度與葉柄長度統(tǒng)計分析 在長日照生長條件下，phyB-9突變體一般只有4片蓮座葉且其葉片及葉柄顯著伸長，因此我們選取Col-0、phyB-9、轉(zhuǎn)基因株系的第3、4片葉，對其葉片長度、葉柄長度進(jìn)行統(tǒng)計，如圖4C-E所示。從以上結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)基因株系的葉片長度及葉柄長度均顯著短于突變體phyB-9，即在擬南芥phyB-9突變體中轉(zhuǎn)入外源ZmPHYB1后，轉(zhuǎn)基因材料的葉片及葉柄變短。由此可見，ZmPHYB1可以抑制phyB-9突變體的伸長反應(yīng)(下胚軸、葉片及葉柄的伸長)，這說明該基因可能是避蔭反應(yīng)的抑制因子。

2.5 ZmPHYB1與AtPIF5互作

研究表明，擬南芥的phyB可以直接與光敏色素互作因子(PIFs)互作[5]。前期實(shí)驗(yàn)表明，ZmPHYB1與擬南芥phyB在功能上存在一定的保守性。推測其通過與擬南芥PIFs互作而行使功能。借助熒光素酶互補(bǔ)成像技術(shù)，可驗(yàn)證玉米PHYB1是否與擬南芥PIFs互作。選取AtPIF5為代表進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，三種形式的ZmPHYB1(PHYB1WT、PHYB1Y98F、PHYB1Y359F)均可以與AtPIF5互作(圖5)，表明ZmPHYB1在擬南芥中可與AtPIF5互作，進(jìn)一步驗(yàn)證了ZmPHYB1與擬南芥PhyB在功能上的保守性。

2.6 轉(zhuǎn)基因株系中避蔭反應(yīng)響應(yīng)基因及生長素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)模式

phyB是擬南芥中響應(yīng)避蔭反應(yīng)的主要光受體，為了驗(yàn)證ZmPHYB1是否參與擬南芥的避蔭反應(yīng)，我們對避蔭反應(yīng)信號通路中的一些重要響應(yīng)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。如圖6所示，通過qRT-PCR檢測避蔭反應(yīng)中的marker基因(ATHB2)與生長素合成marker基因(YUC5)在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)模式，對結(jié)果分析可以看出，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中ATHB2及YUC5的表達(dá)量均顯著低于phyB-9突變體中的表達(dá)量，但均高于野生型，這也從一個側(cè)面解釋了我們的轉(zhuǎn)基因株系為什么不能完全互補(bǔ)phyB-9突變體表型。以上結(jié)果進(jìn)一步表明ZmPHYB1在擬南芥中可以行使PHYB的功能——抑制伸長反應(yīng)。

圖5 LCI驗(yàn)證ZmPHYB1與AtPIF5互作Fig.5 LCI verifies the interaction between ZmPHYB1 and AtPIF5.

圖6 下游響應(yīng)基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of downstream shade responsive genes.A.ATHB2表達(dá)量變化；B.YUC5表達(dá)量變化。*和**表示突變體phyB-9與各株系之間在P<0.05和P<0.01的水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

3 討論

在雙子葉模式植物擬南芥中PHYB具有抑制避蔭反應(yīng)的功能[27～29]。在禾本科植物中PHYB也是調(diào)控避蔭反應(yīng)的主要光受體，但其在玉米避蔭反應(yīng)調(diào)控的遺傳網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)理鮮有研究[19,30～31]。本研究表明ZmPHYB1與擬南芥PhyB存在功能保守性，并且ZmPHYB1可以參與調(diào)控擬南芥的避蔭反應(yīng)。

作物的避蔭反應(yīng)是一種適應(yīng)性反應(yīng)，但其對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分不利。育種家經(jīng)過不斷地實(shí)踐和總結(jié)，提出作物耐密理想株型以減弱或消除避蔭反應(yīng)。理想株型指標(biāo)包括小雄穗、堅(jiān)莖稈、株高適宜等[32]。張世煌[33]指出，高密度育種的首要目標(biāo)在于增強(qiáng)自交系和雜交種的耐密植等抗逆性。研究表明[34]，玉米的莖稈徒長(株高增加)是玉米避蔭反應(yīng)綜合征的典型特征。此外，避蔭反應(yīng)所導(dǎo)致的植株徒長還會加重倒伏的發(fā)生以及減產(chǎn)[35]。陳德龍[36]認(rèn)為，株高和穗位高與倒伏是高度正相關(guān)的。本研究結(jié)果表明ZmPHYB1可以抑制擬南芥的伸長反應(yīng)，故而推測在轉(zhuǎn)基因玉米中同樣會出現(xiàn)株高降低、穗位高降低等表型。擬南芥Y104F(對應(yīng)玉米Y98F突變)氨基酸的替換可增加植株對紅光的敏感性[8]，因此推測玉米Y98F氨基酸的替換也可以使玉米對紅光超敏，進(jìn)而減弱由于密植造成的避蔭反應(yīng)。擬南芥Y361F(對應(yīng)玉米Y359F突變)氨基酸的替換，可以加速PhyB由非活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问絒9]，因此在Y359F殘基替換的轉(zhuǎn)基因株系中PhyB的活性形式積累，降解避蔭反應(yīng)促進(jìn)因子——PIFs，增強(qiáng)了玉米的耐密性。

總之，本研究為耐密植玉米新品種的培育提供了參考，同時也可以啟發(fā)育種工作者篩選這兩個位點(diǎn)的自然變異，以改良玉米的株高、穗位高以及增強(qiáng)耐密性。