錢元霞，湯玲珺，錢 禎，黃曉凡，高 靜，徐衛(wèi)東△

1. 江蘇省鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科(鎮(zhèn)江 212000)；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院(鎮(zhèn)江 212013)

目前，胃癌的發(fā)病率和死亡率在全球居惡性腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著人類的健康，我國(guó)每年新發(fā)病例約40萬(wàn)例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%[1]。一般認(rèn)為，胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程為：慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-不典型增生-胃癌，胃癌前病變(Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)指在慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)基礎(chǔ)上伴發(fā)腸上皮化生和異型增生的病理狀態(tài)[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)胃癌前病變尚缺乏療效肯定的治療藥物及理想的治療方法，中醫(yī)藥從“未病先治”角度出發(fā)，抑制或阻斷PLGC的發(fā)生發(fā)展顯示獨(dú)特優(yōu)越性。四逆散為漢代張仲景所創(chuàng)，由柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草組成，四藥合用，既有調(diào)理肝脾之功，又具調(diào)和氣血之能。四逆散及加味治療慢性萎縮性胃炎及癌前病變?cè)谂R床上有一定的療效[3-5]，但其作用及機(jī)制并不十分清楚，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代藥理學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)，探討四逆散抑制或逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎癌前病變的作用及機(jī)制，為中藥復(fù)方的研究及更好的應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，60只，4周，體重100～120g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXH(蘇)2013-0011，飼養(yǎng)條件、每籠10只，溫度保持在(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%。經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 藥物與試劑 柴胡、白芍、枳實(shí)(炙)、甘草(炙)購(gòu)自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，上述藥材均由江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定；N-甲基-N'-硝基-N'-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)、核黃素：梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胃蛋白酶原I (Pepsinogen I，PG I)、胃蛋白酶原Ⅱ(Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)及胃泌素-17(Gastrin-17，G -17)購(gòu)自sinobestbio公司；兔抗鼠的β-actin多克隆抗體，兔抗鼠的PCNA多克隆抗體、兔抗鼠的Bax多克隆抗體、鼠抗鼠的Bcl-2多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology)，山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗(美國(guó)Proteintech公司)。

3 主要儀器 Spectra Max Gemini熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Device公司),熒光正置顯微鏡(Olympus Corporation)。

4 造模與分組 正常組、模型組、四逆散低劑量組、中劑量組、高劑量組、核黃素組，每組10只，正常組大鼠每天喂基礎(chǔ)飼料，飲用水自由飲用，其余各組具體的造模方法為：200 μg/L 的MNNG液，自由飲用，配以饑飽失常處理，即2 d飽食，1d禁食，共 8 周。于實(shí)驗(yàn)第8周末，從模型組中隨機(jī)取2只大鼠，取胃組織，常規(guī)HE染色，光鏡下2只大鼠均有胃黏膜萎縮性病變，確認(rèn)模型是否復(fù)制成功。第9周開始給藥，四逆散各組每天按10 ml/kg給藥，核黃素組每天1 g/kg。14周后，腹腔注射戊巴比妥鈉處死全部大鼠，留取標(biāo)本觀察指標(biāo)。

5 實(shí)驗(yàn)給藥 參照《中華人民共和國(guó)藥典》中藥制劑通則：按四逆散處方等比例取炙甘草、枳實(shí)、柴胡、白芍藥材，加水10倍浸泡3 h，煎煮2次(第1次8倍量，第2次6倍量)，每次1 h，分離藥渣，保留藥液。將所有藥液混勻濃縮，分別濃縮至0.25 g/ml、0.5 g/ml、1 g/ml，各組合并濾液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

6 觀察指標(biāo)

6.1 一般狀況觀察:每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、大便性狀、毛發(fā)光澤度等，每周記錄體重變化。

6.2 臟器指數(shù)檢測(cè):給藥結(jié)束后，計(jì)算各組大鼠臟器系數(shù)。大鼠器官腎臟、肝臟、脾臟、胸腺稱重后計(jì)算：①腎臟指數(shù)(Kidney index，KI) = 腎臟重量(g) /體重(100g)；②肝臟指數(shù)(Liver index，LI) = 肝臟重量(g) /體重(100g)；③脾臟指數(shù)(Spleen index，SI) = 脾臟重量(g) /體重(100g)；④胸腺指數(shù)(Thymus index，TI) = 胸腺重量(g) /體重(100g)。

6.3 HE染色法觀察胃黏膜組織病理變化:將大鼠禁食24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射(0.8～1.0 ml/只)后，無(wú)菌條件下剖腹，取出整個(gè)胃體，并沿胃大彎剪開，無(wú)菌生理鹽水沖洗，除去胃內(nèi)容物，取胃竇部組織置于10%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋處理后，HE染色作病理組織學(xué)檢查。

6.4 ELISA方法檢測(cè)血清 PG I、PGⅡ及 G -17的含量:采血前禁食不禁水12 h以上，麻醉后通過(guò)頸靜脈取血，靜置30 min，離心(2000 轉(zhuǎn)/min)10 min分離血清。血清用0.2 μm微孔濾膜除菌。應(yīng)用 ELISA 法測(cè)定血清 PG I、PGⅡ及 G -17的含量，計(jì)算PGR(PGⅠ/ PGⅡ)，所有操作均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

6.5 Western blot檢測(cè)蛋白的水平:各組大鼠隨機(jī)選取6只，剖腹取胃，漂洗干凈后，于胃竇部取米粒大小組織，剪碎成 1 mm ×1 mm ×1 mm 大小，加入蛋白質(zhì)抽提試劑，用勻漿器每次30 s低速勻漿，14000 g離心15 min，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。提取組織總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h，一抗孵育4 h，TBST清洗3次，二抗孵育，室溫1 h，TBST清洗3次，ECL發(fā)光液發(fā)光，Minichemi 發(fā)光成像儀檢測(cè)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件，Anova方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般狀況觀察 正常組大鼠活潑，毛發(fā)有光澤，身體強(qiáng)壯，飲食正常，體重自然增加，大便顆粒狀，余亦無(wú)殊。模型組大鼠豎毛，精神較萎靡，體重增長(zhǎng)減緩，食欲下降，大便時(shí)溏，余亦無(wú)殊。各四逆散治療組與核黃素組癥狀較模型組有所改善。

2 四逆散對(duì)大鼠體重及免疫器官系數(shù)的影響 正常組大鼠體重平均從192.9 g增加至258.1 g，平均增加65.2 g，模型組平均增加48.2 g，低劑量組平均增加46.0 g，中劑量組平均增加48.3 g，高劑量組平均增加 14.5 g，核黃素組平均增加53.0 g，其中四逆散高劑量組體重增長(zhǎng)趨勢(shì)最緩，給藥6周后與各組相比有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠的體重變化

表1顯示藥物對(duì)大鼠免疫器官和代謝器官的影響，與正常組、模型組相比，藥物處理組肝臟、脾臟系數(shù)無(wú)明顯差異。四逆散高劑量組的大鼠腎臟系數(shù)與正常組相比有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組胸腺系數(shù)與模型組相比較低，有顯著性差異(P<0.05),劑量濃度較大可能對(duì)大鼠體重有影響，而臟器系數(shù)的下降可能由高劑量組體重明顯下降所致。

3 胃黏膜形態(tài)及病理觀察 肉眼觀察，正常組大鼠胃黏膜正常，色澤淡紅光滑，皺壁完整，無(wú)充血、水腫。模型組大鼠皺壁平，胃壁彈性差，黏膜充血、水腫。四逆散治療組及核黃素各組胃黏膜色淡紅，胃壁彈性較模型組好，水腫癥狀減輕。光鏡下正常組胃黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則。模型組有的粘膜不完整，表面可見(jiàn)脫落的變性、壞死的上皮細(xì)胞，核增大，染色質(zhì)密集深染，有不同程度的異型性，部分伴腸上皮化生。四逆散治療組胃黏膜腸上皮化生程度較模型組輕，尤其是中高劑量組和核黃素組(圖2)。

表1 各組大鼠臟器系數(shù)的比較(g/100g)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

A：正常組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：核黃素組圖2 各組大鼠胃黏膜組織形態(tài)的光鏡觀察(HE染色,×400)

4 四逆散對(duì)血清 PGⅠ、PGⅡ、PGR及 G-17含量的影響 由表2可看出，模型組PGⅠ濃度與正常組相比均值較低，但無(wú)顯著性差異，核黃素組PGⅠ濃度較模型組顯著升高(P<0.05)；PGⅡ濃度模型組與正常組相比明顯升高，四逆散中劑量、高劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05)；模型組PGR值與正常組相比明顯降低，四逆散中、高劑量組、核黃素組與模型組相比明顯升高(P<0.05)；模型組G -17濃度較對(duì)照組低，高劑量組、核黃素組G -17濃度較模型組顯著升高(P<0.05)。

表2 各組血清 PGⅠ、PGⅡ、PGR及 G -17含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

5 PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量 由圖3及表3可看出，與正常組比較模型組Bax蛋白表達(dá)有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);四逆散處理組能夠升高Bax蛋白的表達(dá)。模型組PCNA、Bcl-2蛋白量與正常組相比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),四逆散治療后，中、高劑量組與模型組相比Bcl-2表達(dá)量降低(P<0.05)；高劑量組PCNA與模型組相比表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

圖3 四逆散對(duì)PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量的影響

組 別nBaxBcl-2PCNA正常組100.21±0.04 0.32±0.07 0.14±0.04 模型組80.07±0.01*0.50±0.12*0.55±0.19*低劑量組90.17±0.06#0.52±0.09*0.49±0.11*中劑量組100.20±0.02#0.30±0.03#0.54±0.03*高劑量組80.18±0.07#0.35±0.05#0.31±0.09#核黃素組90.25±0.08#0.36±0.07#0.40±0.04*

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》診斷標(biāo)準(zhǔn)擬定證候診斷,將慢性萎縮性胃炎分為脾胃虛弱型、肝胃不和型、脾胃濕熱型、胃絡(luò)瘀血型、胃陰不足型5型[6]。胃癌前病變多由慢性疾病發(fā)展而來(lái)，久病失調(diào)，導(dǎo)致脾胃之氣損傷，脾胃虛弱，中氣不足，運(yùn)化失司，則胃受納腐熟乏力，出現(xiàn)納呆痞悶、口淡無(wú)味、胃脘隱痛、嘔吐清涎、神疲乏力等表現(xiàn)[7]。如《景岳全書》謂：“胃強(qiáng)則寒不能侮,而寒能勝之，總由脾氣之弱耳”?！捌⑽柑撊酢睘槁晕s性胃炎及其癌前病變的發(fā)病之本，“邪踞胃脘、久釀成毒”是CAG及其癌前病變發(fā)展、演變的病理基礎(chǔ)和關(guān)鍵因素，“脾胃肝同病”是其癌前病變常見(jiàn)的病機(jī)變化，“脾虛及腎”是其癌前病變病機(jī)演變的轉(zhuǎn)歸，“脾虛絡(luò)阻、虛實(shí)夾雜”是貫穿CAG癌前病變始終的基本病機(jī)[8]。故脾胃虛弱是胃癌前病變的病機(jī)演變的必然結(jié)果及關(guān)鍵所在，脾胃虛弱，氣機(jī)升降失調(diào)，運(yùn)化不力，治宜健脾益氣，溫中和胃。四逆散中柴胡為君藥，能透達(dá)郁陽(yáng)，疏肝解郁；芍藥為臣藥，柔肝平肝，養(yǎng)血斂陰，與柴胡相伍，疏肝而不傷陰，一散一斂，有相反相成之效；枳實(shí)為佐藥，理氣消積，以利脾胃，與柴胡相配，一升一降，可增強(qiáng)疏肝理氣之功；炙甘草為使藥，不僅可補(bǔ)益脾胃，還可調(diào)和諸藥，與芍藥合用能柔肝緩急，酸甘化陰，四藥合用，既有調(diào)理肝脾之功，又具調(diào)和氣血之能。

本研究采用MNNG方法復(fù)制慢性萎縮性胃炎癌前病變模型，MNNG是一種在環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)誘變劑和致癌劑，可誘導(dǎo)胃癌前病變大鼠模型的建立[9]。以不同劑量的四逆散給藥，核黃素作陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)四逆散高劑量組可能對(duì)大鼠的體重、腎臟、胸腺有一定的影響，還需擴(kuò)大樣本研究。四逆散能改善病變大鼠胃粘膜形態(tài)和腸上皮化生程度，升高PGⅠ、PGR 、G-17，降低PGⅡ水平。PGⅠ和 PGⅡ，主要由胃底腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌，血清 PG 的水平反映了胃蛋白酶的分泌及不同部位胃黏膜的形態(tài)和功能情況，當(dāng)胃黏膜病變累及分泌胃蛋白酶原的細(xì)胞時(shí)，血清中的 PG 含量也隨之改變[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌前及胃癌病變患者的血清中，PGR較正常組明顯降低，其可作為異型增生、胃癌，尤其是腸型胃癌的診斷標(biāo)記，G-17反應(yīng)胃粘膜的狀態(tài)，與胃粘膜萎縮程度及癌變程度有關(guān)[11-13]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖與凋亡平衡密切相關(guān)，PCNA是細(xì)胞增殖的指標(biāo),與腫瘤等細(xì)胞增殖性疾病的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性，PCNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是一個(gè)逐漸變化的過(guò)程[14-15]。Bcl-2是線粒體上的一種跨膜抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，Bax可以在線粒體外膜上形成孔道,Bcl-2則可通過(guò)與 Bax結(jié)合阻礙線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔道的開放。線粒體外膜通透性增大時(shí)，Cty C等凋亡相關(guān)蛋白從線粒體釋放入胞漿，可導(dǎo)致凋亡小體形成，激活半胱氨酸蛋白酶家族成員Caspase-3的活性，最終導(dǎo)致凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的Bcl-2和Bax 基因異常表達(dá)與引起胃粘膜細(xì)胞凋亡和增殖異常，胃癌及癌前病變的形成發(fā)揮一定作用[17-18]。本研究表明四逆散在一定程度上影響PCNA及Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡過(guò)程。

綜上所述，四逆散在治療慢性萎縮性胃炎癌前病變中有一定的治療作用，能夠在一定程度上改善胃粘膜異型增生程度，可能與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡平衡有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。