劉歡，于鑫淼，王月，王佳月，呂星，侯麗娟，林紫薇，孫立新#（.沈陽藥科大學藥學院，遼寧本溪7004；.本溪市高級中學07級，遼寧本溪 7000）

膽木又名烏檀、熊膽樹，為茜草科烏檀屬植物烏檀[Nauclea officinalis（Pierre ex Pitard）Merr.et Chun]的干燥枝干、根及樹皮[1]。該藥味苦、性寒，在《常用中草藥手冊》《全國中草藥匯編》等書籍均有收載，1977年版《中國藥典》（一部）也有收錄。海南黎族人將膽木作為民間常用草藥用于咽喉炎、感冒發(fā)熱、支氣管炎、急性扁桃體炎等疾病的治療[1-3]。膽木浸膏糖漿由膽木單味藥材開發(fā)研制而成，具有消腫止痛、清熱解毒等功效，臨床常用于治療小兒感冒發(fā)熱[4]、小兒毛細支氣管炎[5]、小兒中耳炎[6]、咽喉炎[7]、急性扁桃體炎[8]等疾病。膽木主要含有生物堿類化合物，也是膽木浸膏糖漿發(fā)揮療效的主要藥效組分[9-12]。沈陽藥科大學藥學院孫立新教授課題組對膽木浸膏糖漿化學成分進行研究發(fā)現(xiàn)，除了分離鑒定出短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺和喜果苷等具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎活性的生物堿類成分外，還從中鑒定出了原兒茶酸、綠原酸、馬錢苷酸等酚酸類化合物和屬于環(huán)烯醚萜類化合物的獐牙菜苷[13]。酚酸類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，獐牙菜苷具有抑菌、解熱作用[13-15]，這些酚酸類化合物和環(huán)烯醚萜類化合物很可能是膽木浸膏糖漿中除生物堿類成分外發(fā)揮臨床療效的重要成分。

目前有關(guān)膽木浸膏糖漿的藥理作用及其臨床應用[4-8]的研究較多，但是對其質(zhì)量控制研究較少，國家藥品標準[16]在含量測定項下要求該制劑總黃酮以無水蘆丁計，不得少于2.2 mg/mL，尚不足以全面評價膽木浸膏糖漿的質(zhì)量。為此，本研究建立了膽木浸膏糖漿的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測定其中原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺和喜果苷共9種成分的含量，以期為膽木浸膏糖漿的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G7111A 1260 Quaternary Pump VL型四元泵、G7115A 1260 WR型二極管陣列檢測器（DAD）、G7129A 1260 Vialsampler型進樣器（美國Agilent公司）；TG332A型微量分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；PB-10標準型pH計（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

膽木浸膏糖漿共20批（批號分別為20161201、20161202 、20161203、20161204、20170101、20170102、20170103、20170506、20170603、20171002、12171102、13171001、12180101、12180102、12180102、13180102、13180103、13171102、13170903、11180307，分別編號為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20，規(guī)格：10 mL/支）均購自海南森祺制藥有限公司；原兒茶酸對照品（批號：Y-031-161227，純度：99.07%）、綠原酸對照品（批號：L-007-171216，純度：99.69%）、馬錢苷酸對照品（批號：M-008-180102，純度：99.36%）、隱綠原酸對照品（批號：Y-067-180425，純度：99.57%）、新綠原酸對照品（批號：X-014-180410，純度：99.83%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；獐牙菜苷對照品（批號：20151208，純度：98%）購自寶雞市辰光生物科技有限公司；短小蛇根草苷對照品（批號：20171025，純度：98.3%）、異長春花苷內(nèi)酰胺對照品（批號：20180710，純度：99.9%）、喜果苷對照品（批號：20180615，純度：98.6%）均由沈陽藥科大學藥學院藥物分析實驗室自制；磷酸、乙腈、甲醇均為色譜純，二氯甲烷、正丁醇均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%A→9%A；10～25 min，9%A；25～30 min，9%A→14%A；30～40 min，14%A→22%A；40～45 min，22%A；45～50 min，22%A→34%A；50～60 min，34%A；60～65 min，34%A→6%A）；柱溫：30℃；檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項下溶液進樣測定，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 取原兒茶酸對照品、新綠原酸對照品、馬錢苷酸對照品、綠原酸對照品、隱綠原酸對照品、獐牙菜苷對照品、短小蛇根草苷對照品、異長春花苷內(nèi)酰胺對照品、喜果苷對照品各適量，置于5 mL量瓶中，用10%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為 862.0、378.0、770.0、392.0、432.0、398.0、420.0、2 428.0、208.0 μg/mL的混合對照品貯備液，4℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 精密量取膽木糖漿劑1 mL，置于5mL量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，制備缺膽木藥材的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成缺膽木藥材的陰性對照溶液。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 參考峰的選擇 根據(jù)圖1B可以看出，24號峰在圖譜中所占的比例較大，與相鄰色譜峰的分離度良好，符合參考峰要求，因此選擇其為膽木浸膏糖漿HPLC指紋圖譜的參考峰。以24號峰為參考峰，分別計算其他峰相對于24號峰的相對保留時間（RRT）與相對峰面積（RPA），并以RRT與RPA為指標進行方法學考察。

2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液（編號：S5）1 mL，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄各共有峰的RRT和RPA。結(jié)果，各共有峰RRT的RSD均小于1.1%（n＝6），RPA的RSD均小于2.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號：S5）1 mL，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各共有峰的RRT和RPA。結(jié)果，各共有峰RRT的RSD均小于1.2%（n＝6），RPA的RSD均小于2.9%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 量取膽木浸膏糖漿（編號：S5）各1mL，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件重復進樣分析，記錄各共有峰的RRT和RPA。結(jié)果，各共有峰RRT的RSD均小于0.76%（n＝6），RPA的RSD均小于2.8%（n＝6），表明本方法重復性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms

2.3.5 不同批次膽木浸膏糖漿的指紋圖譜測定與相似度分析 （1）HPLC指紋圖譜的生成。精密量取20批膽木浸膏糖漿樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對20批膽木浸膏糖漿的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖2、圖3。（2）共有峰的確定與歸屬。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）建立共有模式，繪制對照指紋圖譜。通過與對照圖譜比對，共標定出26個共有峰。（3）相似度分析。將20批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜進行比較，得到各個指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.98，詳見表1。

2.4 含量測定方法的建立

圖2 20批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC superimposed fingerprints of 20 batches of samples

圖3 對照指紋圖譜Fig 3 Referential fingerprint

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 根據(jù)圖1所示，供試品色譜峰與對照品各待測物色譜峰的保留時間基本一致，且指標成分在各自對應的位置無干擾，表明該方法專屬性良好。所有組分于60 min內(nèi)檢測完畢。在該色譜條件下，各個被測成分之間、被測成分與雜質(zhì)峰之間得到分離，9種成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以異長春花苷內(nèi)酰胺峰計大于10 000。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于 5 mL 量瓶中，用10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。分別取上述混合對照品溶液進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得各待測物的回歸方程。將對照品貯備液逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算各物質(zhì)檢測限（信噪比為3∶1）及定量限（信噪比為10∶1），結(jié)果見表2。

表1 相似度分析結(jié)果Tab 1 Results of similarity analysis

2.4.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷峰面積的RSD分別為0.55%、1.2%、0.34%、0.44%、0.21%、0.23%、0.23%、0.22%、0.67%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2 9種待測成分的線性范圍及檢測限、定量限Tab 2 Linear and ranges，detection limits and quantification limits of 9 compounds

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號：S5），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷峰面積RSD分別為0.81%、1.70%、1.20%、0.60%、0.63%、0.85%、1.30%、0.88%、0.99%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 精密量取膽木浸膏糖漿（編號：S5）6份，每份1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷的平均含量分別為479.9、312.8、291.6、258.1、174.1、114.7、125.5、1 768.9、58.4 μg/mL，RSD 分別為0.35%、1.10%、1.70%、0.84%、1.50%、1.50%、1.70%、1.40%、1.30%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的膽木浸膏糖漿（編號：S5）6份，每份0.5 mL。分別加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液（約相當于膽木浸膏糖漿中各成分原有質(zhì)量的100%），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷的平均加樣回收率分別為99.6%、106.3%、100.1% 、102.0% 、98.4% 、100.0% 、99.3% 、100.6% 、101.2%，RSD分別為1.20%、0.24%、0.59%、1.00%、0.73%、1.30%、1.10%、1.80%、1.90%（n＝6）。

2.4.7 耐用性試驗 （1）色譜柱的考察。精密量取膽木浸膏糖漿（編號：S5）3份，每份1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別采用Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（1）（200 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷的平均含量分別為476.8、309.6、291.0、257.0、177.5、115.5、126.1、1 765.5、57.9 μg/mL，RSD 分別為0.91%、1.08%、0.97%、0.98%、1.09%、1.28%、0.92%、0.27%、1.29%（n＝3）。（2）流動相中磷酸加入比例的考察。精密量取膽木浸膏糖漿（編號：S5）3份，每份1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別以乙腈-0.08%磷酸水溶液、乙腈-0.10%磷酸水溶液、乙腈-0.12%磷酸水溶液為流動相，按“2.1”項下梯度洗脫程序進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷的平均含量分別為 477.1、308.9、290.1、258.0、176.1、115.1、124.5、1 763.4、57.9 μg/mL，RSD分別為0.62%、0.94%、0.76%、0.65%、1.40%、1.18%、1.60%、0.40%、1.68%（n＝3）。（3）柱溫的考察。精密量取膽木浸膏糖漿（編號：S5）3份，每份1mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別將柱溫設(shè)置為28℃、30℃、32℃，再按“2.1”項下其余色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算含量。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷的平均含量分別為 476.6、312.6、288.2、257.9、176.8、114.7、125.0、1 766.0、58.3 μg/mL，RSD 分別為 0.74%、0.78%、0.98%、0.70%、0.97%、0.67%、0.76%、0.25%、1.60%（n＝3）。

2.4.8 樣品含量測定 取20批次膽木浸膏糖漿樣品，按“2.2.2”項下平行制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并按標準曲線法計算原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 波長的選擇 文獻[17-19]報道，膽木及其制劑中生物堿類化學成分多在222、227 nm波長處檢測。本試驗通過DAD優(yōu)選檢測波長，主要考察了在226、240、250nm波長處膽木浸膏糖漿各待測物的色譜行為。結(jié)果顯示在240 nm波長處，色譜圖中色譜峰數(shù)較多、峰形較好，故本研究測定波長選擇240 nm。

3.1.2 流動相的選擇 筆者前期分別對乙腈-水、甲醇-水、乙腈-三乙胺磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等體系進行了梯度洗脫試驗。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，所得色譜圖基線更平穩(wěn)，各色譜峰的分離效果最好，故本研究流動相選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液。

3.1.3 柱溫的選擇 筆者前期分別對28、30、32、35℃等4種不同的柱溫進行了考察。結(jié)果表明，30℃時峰形最佳且分離度良好，故本研究柱溫選擇30℃。

3.2 供試品制備方法的考察

筆者前期分別考察了乙醇加熱回流法、乙醇超聲提取法、甲醇超聲提取法和水飽和正丁醇超聲萃取法和水直接溶解法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用水溶解，不損失糖漿劑中的各種成分，且專屬性良好，因此本研究選擇水溶解法作為樣品前處理方法。

表3 9種化合物含量測定結(jié)果（±s，n＝3，μg/mL）Tab 3 Results of content determination of 9 kinds of compounds（±s，n＝3，μg/mL）

表3 9種化合物含量測定結(jié)果（±s，n＝3，μg/mL）Tab 3 Results of content determination of 9 kinds of compounds（±s，n＝3，μg/mL）

編號S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20原兒茶酸373.2±4.2 533.2±0.3 673.1±1.0 317.5±4.0 477.6±0.8 407.5±0.2 516.3±1.4 410.3±0.5 256.6±0.8 250.7±0.9 437.8±1.0 373.3±1.1 133.8±0.6 253.3±2.3 349.4±1.4 293.7±3.8 519.2±9.0 222.4±2.0 636.5±2.5 333.7±0.3新綠原酸356.2±4.3 433.3±0.8 313.4±1.1 273.7±1.8 310.6±1.0 264.9±0.2 247.8±0.3 216.4±1.0 158.8±0.3 95.0±0.1 276.1±0.8 46.2±0.4 222.0±1.6 240.9±2.1 297.5±0.7 282.6±1.9 247.7±0.4 42.2±0.2 145.1±0.4 256.7±1.1馬錢苷酸376.0±1.0 432.3±0.4 373.9±2.9 212.5±2.0 289.6±3.2 258.6±2.0 217.9±1.0 224.5±0.3 199.0±0.2 111.3±0.3 341.9±0.5 99.3±0.5 148.6±0.6 217.1±1.0 169.6±2.2 245.9±3.4 181.0±2.5 126.6±1.6 120.3±0.3 402.5±0.5綠原酸294.9±2.6 362.5±0.4 266.3±0 227.7±0.2 258.5±0.8 221.0±0.2 206.4±1.3 185.7±0.3 142.5±0.9 91.7±0.1 230.7±1.0 43.4±0.5 186.1±0.9 204.4±2.5 252.6±1.0 245.7±1.6 214.7±1.9 46.9±0.4 115.8±0.9 225.8±1.5隱綠原酸200.6±0.7 241.3±1.1 178.4±3.0 152.2±0.1 177.3±1.2 147.4±0.8 137.0±1.1 119.6±0.5 88.0±1.1 50.1±0.3 160.7±0.4 45.9±0.3 119.6±1.5 134.3±1.1 163.5±0.7 154.2±2.3 134.1±1.8 37.6±0.2 76.9±0.4 141.8±0.3獐牙菜苷55.2±0.3 63.6±0.8 108.8±0.5 103.8±0.7 114.3±1.7 122.7±1.2 132.5±1.8 85.0±1.3 99.0±0.8 74.8±0.5 115.2±1.1 42.6±0.5 134.3±1.4 130.0±0.6 88.2±0.2 100.2±0.5 128.8±0.2 55.4±0.9 98.9±0.1 125.6±1.1短小蛇根草苷113.3±1.2 128.3±0.6 177.3±1.8 179.4±2.1 125.5±1.9 127.2±0.2 130.2±0.6 160.5±2.2 164.3±0.8 180.0±0.4 172.1±0.6 220.4±3.5 162.0±1.1 183.0±2.3 160.4±2.2 166.2±0.7 170.2±2.5 253.3±2.0 210.0±2.2 145.0±0.4異長春花苷內(nèi)酰胺1 830.6±33.5 2 037.8±6.8 2 483.7±6.3 2 194.5±4.3 1 766.4±20.9 1 909.3±0.7 1 920.9±0.7 2 408.1±3.9 2 229.8±6.9 2 202.6±2.4 2 655.8±5.0 2 095.7±4.0 1 991.9±4.5 2 235.9±11.4 2 210.3±2.2 2 340.8±14.2 1 992.3±5.1 2 102.0±1.9 1 875.5±2.1 1 532.5±3.0喜果苷52.2±0.1 68.8±0.8 73.1±1.1 64.1±0.4 58.7±1.0 68.2±0.6 63.8±0.7 72.8±0.7 87.3±0.9 59.0±0.3 65.0±0.6 70.1±0.1 54.9±0.3 62.9±0.3 53.7±0.2 61.0±0.6 58.3±0.3 63.9±0.5 69.6±0.4 68.7±0.3

3.3 指紋圖譜與含量測定結(jié)果分析

本研究在指紋圖譜分析中發(fā)現(xiàn)26個共有峰，通過與混合對照品比對，共指認出其中9個化合物，分別為原兒茶酸、新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、短小蛇根草苷、異長春花苷內(nèi)酰胺和喜果苷。為考察膽木浸膏糖漿質(zhì)量，本研究建立了這9種成分含量測定方法，并對20批膽木浸膏糖漿進行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗建立的HPLC指紋圖譜和含量測定法，方法準確、專屬、靈敏。

綜上所述，本研究所建立的膽木浸膏糖漿HPLC指紋圖譜和定量測定方法分析準確度高、專屬性強、靈敏度高，可以為膽木浸膏糖漿的質(zhì)量控制提供可靠方法。