米海燕 羅湘俊

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腎內(nèi)科,衡陽(yáng)421002)

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)在腎間質(zhì)中的過度累積和成纖維細(xì)胞的增殖而形成，是發(fā)生于多種類型腎臟病的共同途徑和主要病理轉(zhuǎn)歸，其主要病理特征為腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及腎小管萎縮等[1]。自20世紀(jì)70年代開始，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物的腎臟病理改變與人體腎間質(zhì)纖維化相似[2]，可以在一定程度上反映人類腎纖維化的病理特征，所以后來采用動(dòng)物單側(cè)輸尿管梗塞制作腎臟間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅粡V泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中[3]。西羅莫司(Sirolimus，Sir)主要應(yīng)用于腎臟、肝臟、胰島移植患者，屬哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑，具有明顯改善慢性移植物腎病作用，主要表現(xiàn)在延緩腎纖維化[4]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù)制備腎間質(zhì)纖維化模型，首先對(duì)大鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎，以時(shí)間分組，觀察不同時(shí)間點(diǎn)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟的病理變化，記錄成造模時(shí)間節(jié)點(diǎn)。根據(jù)該方法，在手術(shù)當(dāng)天復(fù)制模型并將西羅莫司胃內(nèi)注射給模型大鼠，通過分析阻塞性腎間質(zhì)病變情況、TGF-β1表達(dá)及其相關(guān)基因表達(dá)等情況，探討西羅莫司減輕大鼠腎間質(zhì)抗纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠36只，體重(180±20)g。西羅莫司購(gòu)于輝瑞公司。山羊抗兔TβR-Ⅰ(CST 公司)，山羊抗小鼠α-SMA(Sigma 公司)、兔抗大鼠TGF-β1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，Trizol 試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司)。逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)試劑(日本 TaKaRa 公司)。9600PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)。

1.2方法

1.2.1分組及模型的建立 36只大鼠隨機(jī)分為西羅莫司組(Sir組)及單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO組)，同時(shí)建立假手術(shù)組(Sham組)，每組各12只，每組再隨機(jī)分為7 d、14 d兩亞組。Sham組開腹后，分離左側(cè)輸尿管并結(jié)扎，隨后關(guān)閉腹腔，將皮膚進(jìn)行縫合。UUO組和Sir組8%水合氯醛腹腔注射麻醉后均進(jìn)行左側(cè)輸尿管結(jié)扎:在左肋腰點(diǎn)處取一長(zhǎng)3 cm的手術(shù)切口，逐層切開，暴露左腎，腎蒂，找到輸尿管，結(jié)扎左側(cè)輸尿管隨后縫合。Sir組于建模后，給予西羅莫司[2 mg/(kg·d)]灌胃，同時(shí)Sham組和UUO組給予同量的生理鹽水灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2取材 8%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠處死，取出左腎并除去結(jié)締組織和包膜。將血跡洗凈并瀝干，迅速置于液氮中過夜，并在第2天轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，備用。

1.2.3腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將取出的腎組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，包埋，連續(xù)切片，厚度約3 μm，行 HE 染色。

1.2.4大鼠腎組織TGF-β1免疫組化 采用免疫組化SP法。取大鼠腎組織標(biāo)本，經(jīng)4% 多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，于3%過氧化氫溶液室溫放置15 min，水洗，PBS沖洗浸泡2 min，置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波加熱修復(fù)，H2O2封閉，滴加適量稀釋的TGF-β1多克隆抗體，37℃ 2 h，PBS沖洗8 min×3次，加入二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS 沖洗8 min×3次，DAB顯色37℃ 20 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。以 PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性反應(yīng)切片作為陽(yáng)性對(duì)照。TGF-β1陽(yáng)性染色呈棕色。隨機(jī)選取3張免疫組化切片,每張取5個(gè)高倍鏡視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值就是陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.2.5RT-PCR 檢測(cè)梗阻側(cè)腎組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(TGF-β1)mRNA 表達(dá)水平 分別取各組大鼠腎組織100 mg，對(duì)所有樣本進(jìn)行總RNA提取，并測(cè)定濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取各樣本逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，取2 μl cDNA用于RT-PCR反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參，正向引物:5′-CACTGGTCGGGAGTCAGAAC-3′；反向引物:5′-ACAGAACAATA-GGCACAAACG-3′；TGF-β1正向引物:5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′；反向引物:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。RT-PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃ 30 s，變性 94℃ 5 s，退火 60℃，40個(gè)循環(huán)，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，置1.2%瓊脂糖凝膠中(0.5 g/ml溴化乙錠)，將電壓調(diào)至80 V，電泳30 min，凝膠成像，掃描分析，計(jì)算目的基因光密度與β-actin光密度比值。

1.2.6免疫印跡分析 經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì):制備 5%濃縮膠及 12%的分離膠。電泳:調(diào)解電壓至80 V，90 min 后轉(zhuǎn)為100 V至溴酚藍(lán)跑至距分離膠底部0.5 cm 時(shí)停止。轉(zhuǎn)膜:280 mA 恒流1 h，結(jié)束后關(guān)閉電源取出PVDF膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現(xiàn)說明轉(zhuǎn)膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗，4℃冰箱過夜。加二抗37℃ 2 h，結(jié)束后用TBST漂洗10 min×3次后顯影。用 Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)定目的蛋白及β-actin的吸光度并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。計(jì)算公式如下:相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=A目的蛋白/Aβ-actin(A表示吸光度值)。

2 結(jié)果

2.1病理組織學(xué)觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示:7 d 和 14 d Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯損傷，染色均勻，炎性細(xì)胞無(wú)浸潤(rùn)，腎小管無(wú)擴(kuò)張，腎小球及腎小管胞體輪廓正常且清晰，亦可見胞核及核仁。7 d UUO組可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及少量漿細(xì)胞浸潤(rùn)，腎乳頭出現(xiàn)萎縮，腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫情況，腎小管灶性萎縮，結(jié)構(gòu)紊亂，明顯擴(kuò)張導(dǎo)致間質(zhì)區(qū)變寬，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性或出現(xiàn)壞死脫落，腎小球未見明顯病變，其結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞清晰可見。14 d UUO組與7 d UUO組比較腎臟結(jié)構(gòu)的破壞進(jìn)一步加劇。Sir組與UUO組比較，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎小管擴(kuò)張減輕，腎小管細(xì)胞空泡變性減少；14 d Sir組與 7 d Sir組比較病變有所減輕。見圖 1。

2.2各組大鼠腎組織TGF-β1 免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，7 d 和 14 d 時(shí)UUO組大鼠腎組織 TGF-β1 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較同時(shí)間點(diǎn)Sham組明顯增高(P<0.05)；西羅莫司治療后，7 d 和14 d 時(shí)TGF-β1 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較同時(shí)間點(diǎn)模型組減少(P<0.05)；Sir組14 d與 7 d 相比較 TGF-β1 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。見圖2及表1。

2.3TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 RT-PCR 結(jié)果顯示，行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后7 d及14 d，UUO組大鼠 TGF-β1 mRNA表達(dá)量與Sham組相比有明顯差異(P<0.05)，隨著梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)量越高；與相同時(shí)間點(diǎn)的UUO組比較，Sir組7 d和14 d的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖3。

圖1 病理組織學(xué)觀察(×400)Fig.1 Histopathological observation(×400)Note: A,B,C were all 7 days;D,E,F were all 14 days.

圖2 TGF-β1免疫組化觀察(×400)Fig.2 TGF-β1 immunohistochemical observation(×400)Note: A,B,C were all 7 days;D,E,F were all 14 days.

2.4西羅莫司抑制梗阻性腎病大鼠TβR-Ⅰ和α-SMA蛋白的表達(dá) 大鼠腎組織中TβR-Ⅰ和α-SMA的表達(dá):UUO組大鼠(14 d)較Sham組均明顯升高(P<0.01)，Sir組(14 d)大鼠較UUO組(14 d)均明顯降低(P<0.05)。見圖4。

Groupsn7 d14 dtPSham group616.9±1.216.1±2.12.9410.052UUO group648.7±3.31)35.8±2.811)14.224<0.001Sir group633.4±2.11)2)24.3±3.21)2)3)8.902 7<0.001

Note：Compared with Sham group,1)P<0.05; compared with UUO group,2)P<0.05; compared with Sir group, 3)P<0.05.

表2 腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)變化

Tab.2 Changes of TGF-β1 mRNA expression in renal tissue

GroupsTGF-β1 mRNA7 d14 dSham group0.33±0.050.34±0.08UUO group1.14±0.071)1.36±0.091)Sir group0.71±0.052)0.62±0.102)

Note：Compared with Sham group,1)P<0.05; compared with UUO group at the same time point, 2)P<0.05.

圖4 西羅莫司對(duì)TβR-Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Sirolimus on TβR-Ⅰ and α-SMA protein expressionNote: 1.Sham group;2.UUO group(14 d);3.Sir group(14 d);compared with the Sham group,**.P<0.01;compared with the UUO group,#.P< 0.05.

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程較復(fù)雜，涉及腎小管上皮及間質(zhì)的損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、生長(zhǎng)因子分泌增多、纖維母細(xì)胞增殖和球后小管周圍血管閉塞等。腎臟纖維化的治療一直是臨床上的難點(diǎn)[5]，現(xiàn)有的內(nèi)科治療在逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的進(jìn)展方面尚無(wú)效，目前也沒有有效的藥物或治療措施來防止腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn)西羅莫司(Sir)治療后，UUO大鼠出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張程度減輕、腎小管細(xì)胞空泡變性減少、腎乳頭萎縮情況好轉(zhuǎn)、腎臟腫大程度也相應(yīng)減輕及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)減少等，這些癥狀的變化均能反映出Sir對(duì)腎臟的保護(hù)作用，說明Sir能顯著延緩UUO所致的大鼠腎纖維化的進(jìn)展。

大鼠UUO模型是腎間質(zhì)纖維化最常用的動(dòng)物模型[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示，小管損傷的原因是長(zhǎng)時(shí)間的梗阻現(xiàn)象，而損傷的結(jié)果則是腎間質(zhì)的纖維化。UUO大鼠HE染色結(jié)果顯示炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及少量漿細(xì)胞)浸潤(rùn)，腎乳頭出現(xiàn)萎縮，腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫情況，腎小管灶性萎縮，結(jié)構(gòu)紊亂，明顯擴(kuò)張導(dǎo)致間質(zhì)區(qū)變寬，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性或出現(xiàn)壞死脫落，而腎小管上皮細(xì)胞損傷后，水重吸收紊亂，腎小球?yàn)V過率降低，腎臟腫脹，從而腎小管局部形成一個(gè)壓力增加-腎小管損傷的惡性循環(huán)，多個(gè)因素相互促進(jìn)加重腎纖維化的程度。

Sir是一種新型的大環(huán)內(nèi)酯抗生素類強(qiáng)免疫抑制劑[7]，它能與具有相同免疫親和蛋白的FK結(jié)合形成復(fù)合物，其復(fù)合物不能與鈣調(diào)素結(jié)合，但能與西羅莫司靶分子(mTOR)結(jié)合，激活mTOR抑制多種細(xì)胞因子，從而阻止細(xì)胞從G1期發(fā)展至S期，發(fā)揮其免疫作用。最新研究已明確Sir具有抗細(xì)胞增殖和抑制免疫的作用[8，9]，通過對(duì)腎間質(zhì)纖維化本質(zhì)的探討，有研究認(rèn)為Sir抑制免疫炎癥反應(yīng)的作用可應(yīng)用于RIF的治療[10]。據(jù)報(bào)道隨訪4 年后發(fā)現(xiàn)，西羅莫司組的腎移植存活率高于環(huán)孢素組(77.3% vs 55.2%)，而腎小球?yàn)V過率在 30、36、42、48 個(gè)月時(shí)均明顯高于環(huán)孢素組(均P<0.05)[11]；臨床研究還顯示，與環(huán)孢素組相比，西羅莫司組的腎移植生存率高、移植功能更好[12]。

TGF-β超家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子亞家族組成，目前認(rèn)為該家族能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化，TGF-β1是TGF-β超家族的一員，是作用最強(qiáng)的致腎纖維化細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)多種信號(hào)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，從而成為促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵因子，TGF-β1主要依賴于TGF-β超家族信號(hào)蛋白Smad 蛋白家族介導(dǎo)其信號(hào)傳遞，先后結(jié)合 TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ，形成具有激酶活性的四聚體復(fù)合物，激活的TβR-Ⅰ激活酶磷酸化其下游因子 Smad2、Smad3，使Smad2、Smad3 與 Smad4 形成復(fù)合物，介導(dǎo)TGF-β信號(hào)從胞質(zhì)傳入胞核中[13-15]，從而特異性調(diào)節(jié)相關(guān)的纖維化靶基因的表達(dá)，如α-SMA的表達(dá)[13，16]，而西羅莫司通過與 mTOR 結(jié)合，對(duì)活化T和B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子進(jìn)行抑制，成為腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中的“阻斷劑”[17,18]。在腎間質(zhì)纖維化時(shí)，約36%的肌成纖維細(xì)胞(MyoFb)由小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來，α-SMA作為血管平滑肌細(xì)胞的主要成分，是MyoFb激活的特異性標(biāo)志蛋白。α-SMA在正常腎小球和腎小管細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時(shí)出現(xiàn)表達(dá)。有研究表明腎間質(zhì) α-SMA 表達(dá)增多會(huì)促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，UUO組7 d、14 d 大鼠，腎組織TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)水平增加，同時(shí)Western blot檢測(cè)α-SMA 蛋白表達(dá)量也明顯增加，這提示左腎組織損傷。而Sir組7 d、14 d較相同時(shí)間點(diǎn)的UUO組比較，TGF-β1蛋白和mRNA的表達(dá)均減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:UUO組腎組織中的TβR-Ⅰ和α-SMA表達(dá)水平較Sham組大鼠明顯升高(P<0.01)，而較Sir組明顯降低(P<0.05)。這提示Sir可能通過抑制和干擾TGF-β1的表達(dá)，減少α-SMA的表達(dá)，降低腎間質(zhì)MyoFb的數(shù)量從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

綜上，本研究證實(shí)Sir治療能夠緩解UUO大鼠腎小管局部壓力的增加，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而保護(hù)腎小管細(xì)胞、減輕腎纖維化。同時(shí)我們認(rèn)為Sir抗纖維化的機(jī)制可能與抑制mTOR/TGF-β1-Smad信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)通道的表達(dá)有關(guān)，但其明確的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。