汪 琦 劉曉波 譚浩明 邱敏嬋

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣州510006)

在正常機(jī)體環(huán)境中，免疫檢查點(diǎn)可對免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)性進(jìn)行調(diào)節(jié)，防止在清除異常細(xì)胞過程中損傷正常組織，而在腫瘤微環(huán)境中，免疫檢查點(diǎn)通路被利用，抑制性信號被進(jìn)一步放大，T細(xì)胞功能受到抑制，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[1]。通過抗體阻斷免疫檢查點(diǎn)抑制性信號通路，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗腫瘤活性，達(dá)到抗腫瘤的效果。近年來，免疫檢查點(diǎn)治療已經(jīng)成為抗腫瘤治療的熱點(diǎn)之一，在T細(xì)胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了29個免疫球蛋白超級家族，為免疫檢查點(diǎn)療法抗腫瘤治療提供了廣闊的發(fā)展前景[2]，T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule-3,TIM3)就是其中備受關(guān)注的免疫檢查點(diǎn)之一。

TIM3是一種跨膜糖蛋白，屬于TIM 家族，其基本結(jié)構(gòu)包括信號肽、免疫球蛋白樣區(qū)、黏蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和具有磷酸化位點(diǎn)的胞內(nèi)區(qū)，研究顯示，TIM3在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤的免疫逃逸、發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。利用抗TIM3抗體靶向封閉TIM-3的表達(dá)，可增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的增殖和效應(yīng)因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]，同時還可改善自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的增殖，恢復(fù)NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖[4]。抗TIM-3抗體在腫瘤診斷和治療中應(yīng)用廣闊，但目前國內(nèi)外尚未有抗TIM-3抗體藥物上市。本研究通過雜交瘤技術(shù)制備抗人TIM3 單克隆抗體，經(jīng)過多次篩選，獲得一株分泌抗人TIM3單克隆抗體細(xì)胞株FD12，純化的抗體對肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有一定的抑制作用，研究結(jié)果將為進(jìn)一步藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用RPMI1640、DMEM高糖培養(yǎng)基、氨芐青霉素-鏈霉素均為美國Gibco公司產(chǎn)品，HAT、HT、弗氏完全和不完全佐劑購自美國Sigma公司，聚乙二醇2000購自BBI公司，羊抗小鼠IgG/HRP為武漢博士德產(chǎn)品，ELISA顯色試劑購于碧云天生物技術(shù)公司，BCA蛋白定量試劑盒購于康為世紀(jì)，抗體亞型鑒定試劑盒購于北京博奧龍生物公司，胎牛血清、小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。

小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與制藥學(xué)院田素娟教授惠贈，HepG2細(xì)胞由廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院張?jiān)伬蚪淌诨葙?正常人肝細(xì)胞L7702由本室保種。多肽序列由蘇州強(qiáng)耀生物公司體外合成。實(shí)驗(yàn)動物為雌性BALB/c小鼠，8周齡，由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2方法

1.2.1抗原表位的篩選及合成 從Genebank獲得人TIM3基因和蛋白序列(accession NM_032782.4)，利用www.nih.gov中抗原表位分析預(yù)測軟件進(jìn)行抗原表位的篩選。篩選出的氨基酸片段，由蘇州強(qiáng)耀公司合成。

1.2.2小鼠免疫 小鼠4只，3只免疫TIM3多肽，1只作為正常對照。常規(guī)方法免疫。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為20%的小牛血清1640，肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)基為10%胎牛血清的高糖DMEM，肝細(xì)胞L7702的培養(yǎng)基為10%的小牛血清DMEM，細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%CO2和37℃。

1.2.4細(xì)胞融合 常規(guī)方法進(jìn)行。小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合比例為10∶1。

1.2.5雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆 常規(guī)HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，HT過渡培養(yǎng)。常規(guī)間接ELISA法檢測上清液抗體滴度。選擇OD值最高的3個孔細(xì)胞，混勻并稀釋到10個細(xì)胞/ml，鋪板篩選。收集單克隆孔上清液檢測抗體滴度。選擇最高OD值3孔細(xì)胞，再次鋪板篩選，重復(fù)至所有單克隆細(xì)胞孔檢測均為陽性。

1.2.6單抗的純化及亞型測定 辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗TIM3單克隆抗體，BCA法定量抗體蛋白。亞型鑒定按說明書進(jìn)行。

1.2.7MTT法檢測肝癌細(xì)胞增殖 HepG2細(xì)胞濃度2×106個/ml，每孔100 μl。細(xì)胞培養(yǎng)12 h僅加入一次抗體，為單次加藥實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)12 h和24 h 分別加入等量的抗體，為連續(xù)加藥實(shí)驗(yàn)。MTT工作液濃度為5 mg/ml，常規(guī)檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，進(jìn)行組間差異分析。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠血清抗體效價的測定 血清按1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000稀釋，正常小鼠血清1∶200稀釋作為對照。1號小鼠效價如表1所示。

2.2陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 雜交瘤融合率達(dá)80%。間接ELISA法檢測，篩選OD值最大的3個孔，進(jìn)行第一次亞克隆。重復(fù)上述步驟，直至所有的單克隆孔為陽性。表2為最終篩選的陽性孔。

2.3抗TIM3單克隆抗體FD12的亞型鑒定、純化及定量 膠體金試劑盒檢測顯示分泌的抗體為免疫球蛋白G(IgG)，輕鏈為kappa鏈 (κ鏈)。根據(jù)亞型鑒定結(jié)果，選擇辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體，BCA法檢測純化蛋白的濃度為0.3 mg/ml。

2.4抗TIM3單克隆抗體對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制 純化的抗TIM3抗體首先檢測其對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖影響。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為PBS作用于肝細(xì)胞、PBS作用于肝癌細(xì)胞、抗TIM3抗體作用于肝細(xì)胞、抗TIM3抗體作用于肝癌細(xì)胞。結(jié)果顯示，12 h后抗TIM3抗體明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，和其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而抗TIM3抗體對肝細(xì)胞的增殖未出現(xiàn)明顯抑制，t檢驗(yàn)顯示和PBS實(shí)驗(yàn)對照組無顯著差異，說明本課題組制備的抗TIM3抗體具有抑制腫瘤增殖的活性，對正常細(xì)胞增殖無影響(圖1)。隨后課題組對抗體的藥效及給藥方式進(jìn)行了進(jìn)一步研究。單次加藥后36 h檢測肝癌細(xì)胞的增殖，結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，實(shí)驗(yàn)組和PBS對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明抗體在36 h后依然具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的活性(圖2)。在細(xì)胞培養(yǎng)12、24 h分別加入抗體，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測，結(jié)果顯示，抗體對HepG2增殖具有明顯抑制作用，實(shí)驗(yàn)組和對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且連續(xù)加藥具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)(圖3)。

表1 間接ELISA測定小鼠血清抗體效價

Tab.1 Serum antibody titters of mice determined by indirect ELISA

Dilution ratioof serumA492 value(x±s)A ratio(immunized mice/normal mice)Mouse No.11∶1 0002.56±0.01234.591∶2 0002.22±0.03830.001∶5 0001.88±0.00925.41Normal mouse1∶2000.074±0.0081.00

表2 陽性單克隆抗體篩選結(jié)果

Tab.2 Scanning of specific anti-TIM3 antibody

No.PositionOD valueNo.PositionOD valueNo.PositionOD value1A40.97312C101.20923E50.9932A101.05613C110.98324E61.0313A110.94114C120.92225E71.7404B30.99715D11.11126E91.0235B60.9516D21.04727E101.0496B100.92417D30.91128E110.9907C20.92518D40.93629E120.9378C60.98219D60.94230F11.1339C71.06720D81.04131F21.16510C80.96421D100.967Blank controlH120.04711C90.98422E30.917Negative controlH110.306

圖1 抗TIM3抗體對肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of anti-TIM3 antibody on proliferation of liver cells and HepG2 cells

圖2 抗體36 h后對HepG2增殖的影響Fig.2 Effect of anti-TIM3 antibody on proliferation of HepG2 at 36 hours

圖3 兩次抗體加藥對HepG2增殖的影響Fig.3 Effect of anti-TIM3 antibody on proliferation of HepG2 with two dosings

3 討論

腫瘤免疫逃逸一直是治療難題，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物能阻斷腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞監(jiān)視攻擊的能力[5]，阻斷PD-1、CTLA4信號途徑的藥物已進(jìn)入臨床，并取得良好療效，但也存在著諸如脫靶效應(yīng)、個體療效差異等問題，研發(fā)更多的免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物迫在眉睫，TIM3就是目前熱門的候選靶點(diǎn)之一。

TIM3最初被認(rèn)為僅表達(dá)于Th1細(xì)胞，隨后發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞、Treg、DC、NK細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞均可表達(dá)[6]。異于其他免疫檢查點(diǎn)分子，TIM3誘導(dǎo)性表達(dá)于炎癥和腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞表面。在腫瘤組織浸潤C(jī)D4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，TIM3的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其異常表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)[7,8]，腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞上TIM3的高表達(dá)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中，TIM3在NSCLC浸潤巨噬細(xì)胞上過表達(dá)，并與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)[9]。腫瘤微環(huán)境中TIM3影響髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)的增殖和抑制NK細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[10]。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，TIM3通過與配體的結(jié)合，引起T細(xì)胞衰竭，目前已發(fā)現(xiàn)的TIM3配體有三種:半乳糖凝集素9(Galactin 9,Gal-9)、高遷移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(Carcino-embryonic antigen related cellular adhesion molecule 1,CEACAM1)，TIM3與配體結(jié)合所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前仍不清楚。但毫無疑問，由TIM3誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的重要原因之一。抗TIM3和抗Gal-9抗體可以解除由過量Gal-9表達(dá)特異性誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的凋亡，恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[11]。TIM3阻斷劑能夠提高機(jī)體固有免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)[12]。在HNSCC小鼠模型中，靶向抑制TIM3可誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞降低，增強(qiáng)抗癌免疫反應(yīng)[13]?？筎IM3抗體還可促進(jìn)IFN-γ介導(dǎo)的T-細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長[14]。

縱觀目前文獻(xiàn)中靶向TIM3治療腫瘤的機(jī)理，均涉及T-細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。但本課題組將HepG2細(xì)胞株與抗體共孵育，卻檢測到HepG2細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，HepG2是高表達(dá)TIM3的細(xì)胞株，是否封閉TIM3靶點(diǎn)可以直接作用于高表達(dá)TIM3的腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)其凋亡，仍需要進(jìn)一步的研究。本次實(shí)驗(yàn)所用抗體采用辛酸-硫酸銨沉淀法，所獲抗體純度不高，但作用于HepG2細(xì)胞，卻顯著抑制該細(xì)胞的增殖，表明所制備的抗TIM3抗體可能具有較高的抑癌活性，為進(jìn)一步深入研究該抗體的抗腫瘤活性及臨床研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。