孟佩盈 趙 君 陳莎帥

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是由于冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血或壞死的一類(lèi)心臟疾病，簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病，其發(fā)病機(jī)制多樣[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是由于機(jī)體胰島素受體功能異常產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致高血糖的一類(lèi)糖尿病，多發(fā)于中老年，常伴有高血脂、高血壓、CAD等疾病[2]。研究表明，糖尿病患者機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，血管屏障受到損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞間連接減弱，伸縮性降低，導(dǎo)致血管閉塞發(fā)生硬化，加劇糖尿病患者血管病變[3]。相關(guān)研究表明，多種miRNAs參與CAD疾病和T2DM疾病發(fā)生過(guò)程[4]。另有研究表明C-X-C基趨化因子12(C-X-C motif chemokine 12，CXCL12)在T2DM疾病及其并發(fā)癥發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[5]。然而CXCL12與T2DM合并CAD患者冠脈病變程度的關(guān)系尚不清楚。因此本研究納入2016年4月～2018年4月筆者醫(yī)院接收的CAD患者進(jìn)行研究，旨在檢測(cè)miR-26、CXCL12在T2DM伴CAD患者血清中表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析miR-126、CXCL12水平與患者冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，探究miR-126、CXCL12水平與冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，以期為早期干預(yù)和預(yù)后判斷提供一定參考。

資料與方法

1.一般資料：選取2016年4月～2018年4月在筆者醫(yī)院進(jìn)行治療的穩(wěn)定型CAD患者103例，根據(jù)是否伴T(mén)2DM分為伴糖尿病組(CADDM組)49例、非伴糖尿病組(CAD組)54例。所有患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確定冠狀動(dòng)脈病變情況，采用Gensini評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估冠脈病變程度[6]。CADDM組男性27例，女性22例；患者平均年齡62.54±7.93歲。CAD組男性31例，女性23例，平均年齡61.29±8.37歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)穩(wěn)定型CAD：以發(fā)作性胸骨后疼痛為特點(diǎn)，發(fā)作1～3個(gè)月內(nèi)無(wú)改變，發(fā)作在每日及每周的次數(shù)大致一致，誘導(dǎo)發(fā)作的情緒和勞累程度無(wú)差別，發(fā)作時(shí)疼痛性質(zhì)及發(fā)作部位每次無(wú)改變。(2)T2DM：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)的中國(guó)T2DM防治指南(2013年)，75g OGTT后2h血糖值≥11.1 mmol/L和(或)FPG≥7.0 mmol/L，且排除1型糖尿病，即診斷為T(mén)2DM。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并心肌炎等其他心臟病。(2)不穩(wěn)定型心絞痛，腎臟、肝臟功能異常。(3)合并局部出血性疾病，不能長(zhǎng)期進(jìn)行抗血小板治療。(4)合并血液系統(tǒng)、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)、嚴(yán)重感染等疾病。另招募同期健康體檢者50例為對(duì)照組，男性28例，女性22例，平均年齡60.29±7.64歲。3組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，且研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.血清miR-126水平檢測(cè)：所有研究對(duì)象均于入院24h內(nèi)(對(duì)照組于體檢當(dāng)日)抽取靜脈血4ml，離心收集血清，Trizol法提取組織中總RNA，試劑盒富集miRNAs。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板對(duì)miR-126進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)研究組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組計(jì)算miR-126相對(duì)表達(dá)量。

3.血清CXCL12水平檢測(cè)：采用人CXCL12酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物公司)檢測(cè)各研究對(duì)象血清中CXCL12蛋白水平。

結(jié) 果

1.3組受試者一般資料的比較：3組受試者年齡、性別、BMI、吸煙及高血壓情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，CAD組和CADDM組患者TC、TG、LDL-C和HOMA-IR均顯著升高，HDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CAD組比較，CADDM組患者TC、TG、LDL-C和HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05),詳見(jiàn)表1。

2.3組受試者血清miR-126、CXCL12水平的比較：與對(duì)照組比較，CAD組和CADDM組患者血清中miR-126顯著降低、CXCL12水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CAD組比較，CADDM組患者miR-126顯著降低、CXCL12水平明顯增高(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

3.CAD組和CADDM組患者Gensini評(píng)分的比較：與對(duì)照組比較，CAD組和CADDM組患者Gensini評(píng)分均顯著增高(P<0.05)；與CAD組比較，CADDM組患者Gensini評(píng)分顯著增高(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表1 3組受試者一般資料的比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CAD組比較，#P<0.05

表2 CADDM患者與對(duì)照組血清免疫球蛋白水平的比較結(jié)果

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CAD組比較，#P<0.05

表3 3組受試者Gensini評(píng)分的比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CAD組比較，#P<0.05

4.CADDM患者血清miR-126、CXCL12水平與Gensini評(píng)分相關(guān)性分析：Pearson分析表明，CADDM患者血清miR-126與Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.559，P<0.05)，CXCL12水平與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.658，P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

5.CADDM患者血清miR-126、CXCL12水平對(duì)Gensini評(píng)分的影響：多元線性回歸分析表明，Gensini評(píng)分與miR-126、CXCL12、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HOMA-IR水平呈線性回歸關(guān)系?；貧w系數(shù)顯示，miR-126、CXCL12水平對(duì)Gensini評(píng)分影響較大(r=-0.587、r=0.561，P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

討 論

近年來(lái)，隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，心腦血管類(lèi)疾病在我國(guó)發(fā)生率逐年增加，冠心病具有高致殘率、高病死率等特征，嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康和生命安全，給家庭和社會(huì)造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。糖尿病尤其是2型糖尿病(T2DM)，能促進(jìn)心血管發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心血管病變的發(fā)生，是冠心病的一種危癥[8]。臨床多以冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度衡量CAD疾病嚴(yán)重程度，作為制定治療方案和判斷預(yù)后的主要參考，然而，動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制尚不清楚。因此，尋找與冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)的生物指標(biāo)，探究其與冠狀病變的關(guān)系，可為臨床治療和預(yù)后判斷提供一定參考。

表4 多元線性回歸分析結(jié)果

微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物中一種包含17～25個(gè)堿基的非編碼RNA，其作用是靶向和誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA的降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平引起基因沉默。miRNA參與了基因表達(dá)的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后控制，對(duì)血管組織發(fā)育、粥樣斑塊的形成、免疫和炎性反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用[9]。在心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，各種miRNAs發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Zhao等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-214在缺血性心臟病及心力衰竭患者血清中低表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖和凋亡的靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與心臟病理變化。Elton等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p在心血管疾病患者及病毒感染等患者血清中表達(dá)上調(diào)，與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，推測(cè)可采用減弱miR-155-5p水平的方式進(jìn)行治療。以上研究表明，多種miRNAs參與心血管疾病發(fā)生過(guò)程，然而miR-126在糖尿病伴心血管疾病中作用研究相對(duì)較少。

miR-126是哺乳動(dòng)物一種常見(jiàn)miRNA，一般情況在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，維持血管穩(wěn)定性。Wei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程，影響炎癥所致血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致血管發(fā)生炎性反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變，提示miR-126可能是評(píng)估動(dòng)脈硬化的一種潛在血清標(biāo)志物。Mondadori等[13]研究表明，層流剪切應(yīng)力作用下人內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126表達(dá)上調(diào)，采用miR-126模擬物處理可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)，提示miR-126與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)。Pishavar等[14]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-126在T2DM患者血清中低表達(dá)，可通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和血管完整性參與糖尿病疾病發(fā)生。以上報(bào)道提示，miR-126既與動(dòng)脈粥樣硬化類(lèi)疾病發(fā)生有關(guān)，又可參與糖尿病疾病發(fā)生，但其在糖尿病伴心血管疾病發(fā)生中作用暫時(shí)未知。本研究發(fā)現(xiàn)，CADDM患者和CAD患者血清中miR-126表達(dá)量均顯著低于健康受試者，且T2DM伴CAD患者降低更加顯著，與Al-Kafaji等[15]在T2DM合并CAD患者中發(fā)現(xiàn)一致，提示miR-126下調(diào)可能參與2型糖尿病伴心血管疾病發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-126水平與CADDM患者Gensini評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示血清miR-126水平一定程度上可反應(yīng)T2DM伴CAD患者冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度。

曾有研究者提出，炎性反應(yīng)在心血管疾病和糖尿病的免疫學(xué)機(jī)制中具有重要作用[16]。C-X-C基趨化因子12(C-X-C motif chemokine 12，CXCL12)是趨化因子家族中的一種小細(xì)胞因子，表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中，通常由TNF-α等促炎性刺激因子誘導(dǎo)表達(dá)，也被稱(chēng)為基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF1)[17，18]。Tavakolian等[19]對(duì)88例冠狀動(dòng)脈阻塞患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示冠狀動(dòng)脈阻塞患者血清中CXCL12水平顯著身高，與冠狀動(dòng)脈閉塞的嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)。Zhang等[20]研究顯示，缺血性腦卒中患者梗死區(qū)域中SDF1蛋白表達(dá)量明顯高于臨近正常組織和對(duì)照組，進(jìn)一步研究顯示，SDF1蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞，提示SDF1蛋白表達(dá)上調(diào)可能與缺血性腦損傷有關(guān)。與Tavakolian等在冠狀動(dòng)脈阻塞患者中研究一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，CAD組和CADDM組患者血清CXCL12水平均明顯升高，其中CADDM患者升高更顯著，且與CADDM患者Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，提示血清CXCL12水平升高可能與T2DM伴CAD患者冠狀動(dòng)脈病變發(fā)生和嚴(yán)重程度有關(guān)。

綜上所述，CAD患者血清中miR-126表達(dá)下調(diào)，CXCL2表達(dá)上調(diào)，合并T2DM患者下調(diào)或上調(diào)更顯著，冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度與miR-126水平呈負(fù)相關(guān)，與CXCL12水平呈正相關(guān)，推測(cè)檢測(cè)CAD合并T2DM患者血清miR-126、CXCL12水平可為臨床診治和預(yù)后判斷提供一定參考。