王全勝 艾熱提 路菲菲

急性腎損傷是臨床手術(shù)的常見并發(fā)癥，其可顯著增加慢性腎臟疾病和患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)[1]。炎性小體(NLRP3)是免疫炎性反應(yīng)的重要組成部分，參與了急性腎損傷、糖尿病腎病及慢性腎臟病的發(fā)生、發(fā)展過程[2～4]。有研究顯示，NLRP3的激活可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的合成與分泌，引發(fā)腎臟炎性反應(yīng)和纖維化[5]。右美托咪定是一類高選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，其受體廣泛分布于腎臟近曲和遠(yuǎn)曲小管[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，右美托咪定可顯著減輕重要臟器如心臟、肝臟、腎臟等缺血再灌注損傷，及其引發(fā)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、壞死[7～9]。右美托咪定能否通過降低NLRP3表達(dá)，減輕腎缺血再灌注損傷，目前研究尚不清楚。因此，本研究擬評(píng)價(jià)右美托咪定在腎缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其與NLRP3的關(guān)系。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立:SD清潔級(jí)雄性大鼠32只(12～14周，體質(zhì)量230～250g)由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證：SCXK(新)2011-0004。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組(Sham組,n=8)、腎缺血再灌注損傷組(I/R組,n=8)、腎缺血再灌注損傷+右美托咪定預(yù)處理組(I/R+Dex預(yù)處理組,n=8)和腎缺血再灌注損傷+右美托咪定后處理組(I/R+Dex后處理組,n=8)。大鼠腎缺血再灌注損傷模型參考文獻(xiàn)[10]。簡(jiǎn)要操作如下：經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg，美國(guó)Sigma公司)麻醉大鼠后，經(jīng)腹部正中切開，暴露雙側(cè)腎臟，分離腎蒂。Sham組為僅暴露分離雙側(cè)腎蒂后，關(guān)閉腹腔；I/R組為夾閉雙側(cè)腎蒂，阻斷供血45min后，松開血管夾，再灌注24h；I/R+Dex預(yù)處理組為缺血前1h腹腔注射右美托咪定(美國(guó)Pfizer公司)10μg/kg；I/R+Dex后處理組為再灌注后1h腹腔注射右美托咪定10μg/kg。再灌注24h后收集上述各組腎臟組織標(biāo)本。

2.血肌酐和尿素氮水平檢測(cè):各組大鼠于腎缺血再灌注24h后鼠尾靜脈血，1500×g離心5min，取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)各組血清上述指標(biāo)。

3.TNF-α和IL-10的水平的檢測(cè)：各組大鼠于腎缺血再灌注24h后鼠尾靜脈血，1500×g離心5min后，取上清，采用ELISA試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)檢測(cè)各組大鼠炎性指標(biāo)如TNF-α和IL-10水平。

4.TUNEL染色:取上述腎臟組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟切片，加入20μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，采用TUNEL試劑盒(德國(guó)Roche公司)提供的檢測(cè)液，加入50μl，室溫孵育。用抗熒光淬滅封片液封片后觀察，每張片放大400倍，隨機(jī)取5個(gè)視野，進(jìn)行凋亡細(xì)胞(棕褐色或棕黃色顆粒)和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)÷總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

5.免疫印跡法檢測(cè)腎臟NLRP3、凋亡信號(hào)(caspase-1、Bcl-2)的表達(dá)水平:提取各組大鼠腎臟組織蛋白，50μg組織蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移置硝基纖維素膜，給予5%脫脂牛奶封閉2h，分別孵育鼠抗NLRP3抗體(1∶400，英國(guó)Abcam公司)、caspase-1抗體(1∶300，英國(guó)Abcam公司)、Cleaved caspase-1抗體(1∶400，英國(guó)Abcam公司)、Bcl-2抗體(1∶400，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)及抗GAPDH抗體(1∶400，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，4℃避光孵育過夜。次日取出膜，給予避光室溫孵育熒光羊抗兔二抗(1∶11000)，采用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，并計(jì)算目的條帶與GAPDH灰度比值。

結(jié) 果

1.各組大鼠腎功能水平比較:與Sham組比較，I/R組、I/R+Dex預(yù)處理組及I/R+Dex后處理組血肌酐和尿素氮水平均明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Dex預(yù)處理組和I/R+Dex后處理組血肌酐和尿素氮水平均明顯降低(P<0.05)；而I/R+Dex預(yù)處理組和I/R+Dex后處理組比較，血肌酐和尿素氮水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠腎功能水平比較

與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

2.各組大鼠血清炎性因子水平比較:與Sham組比較，I/R組、I/R+Dex預(yù)處理組及I/R+Dex后處理組血清TNF-α和IL-10水平均明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Dex預(yù)處理組和I/R+Dex后處理組上述指標(biāo)均明顯降低(P<0.05),詳見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較

與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

3.各組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡水平比較:Sham組未發(fā)現(xiàn)明顯的腎小管細(xì)胞凋亡，而I/R組、I/R+Dex預(yù)處理組及I/R+Dex后處理組較Sham組腎小管細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)；而與I/R組比較，I/R+Dex預(yù)處理組和I/R+Dex后處理組腎小管細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.05,圖1)。

圖1 各組大鼠腎小管凋亡水平(×400)A.Sham組；B.I/R組；C.I/R+Dex預(yù)處理組;D.I/R+Dex后處理組

4.各組大鼠腎組織NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1和Bcl-2表達(dá)水平:與Sham組比較，I/R組腎組織NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1表達(dá)水平均明顯升高，而Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Dex預(yù)處理組和I/R+Dex后處理組腎組織NLRP3、caspase-1、Cleaved caspase-1表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、caspase-1和Bcl-2表達(dá)水平與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

討 論

相關(guān)研究顯示，右美托咪定可保護(hù)重要臟器如腎臟、肝臟及心臟等缺血再灌注損傷，但機(jī)制還不完全清楚[11～13]。本研究結(jié)果顯示，右美托咪定保護(hù)腎臟缺血再灌注損傷與降低NLRP3表達(dá)有關(guān)。腎臟缺血再灌注損傷可增加NLRP3和caspase-1的水平，而給予右美托咪定處理，可顯著逆轉(zhuǎn)上述作用，同時(shí)降低體內(nèi)炎性水平，表現(xiàn)為TNF-α降低和IL-10的升高。

血肌酐和尿素氮水平是臨床評(píng)判腎功能的重要指標(biāo)，在急性腎損傷、慢性腎功能不全等，可顯著升高。本研究通過建立腎臟缺血再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組血肌酐和尿素氮水平顯著升高，表明腎缺血再灌注引起了腎功能顯著受損，提示模型制備成功。NLRP3是由胞質(zhì)內(nèi)多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，其含有凋亡相關(guān)微粒蛋白、caspase-1等，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)NLRP3受外在刺激被激活時(shí)，活化的caspase-1隨后激活I(lǐng)L-1β和IL-18，產(chǎn)生炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。相關(guān)研究顯示，NLRP3可促進(jìn)腎臟相關(guān)疾病如慢性腎功能不全及糖尿病腎病的進(jìn)展，同時(shí)其可作為潛在的治療靶點(diǎn)[15,16]。抑制NLRP3激活可顯著降低糖尿病腎病的炎性反應(yīng)，改善腎功能及預(yù)后[17]。

右美托咪定是高選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗交感作用，同時(shí)其受體在腎臟具有廣泛分布，對(duì)腎臟缺血再灌注損傷具有顯著保護(hù)作用，但機(jī)制不清。已有研究表明，右美托咪定通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，降低炎癥及氧化應(yīng)激，從而對(duì)重要器官缺血損傷起保護(hù)作用[18]。因此，筆者假設(shè)通過抑制NLRP3，降低炎癥及細(xì)胞凋亡，可能參與了右美托咪定對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，腎臟缺血再灌注損傷可顯著增加NLRP3、caspase-1及Cleaved caspase-1的表達(dá)，而右美托咪定可顯著抑制NLRP3激活，降低炎性反應(yīng)即TNF-α降低而IL-10升高，進(jìn)一步抑制凋亡通路的激活。TNF-α和IL-10是單核-吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎性因子，可進(jìn)一步刺激中性粒細(xì)胞分泌趨化因子及黏附因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)的放大[19]。以往研究顯示，炎癥可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡是器官缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一，在細(xì)胞凋亡通路中，caspase-1是重要的剪切酶，抑制caspase-1活性可顯著減輕細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，腎臟缺血再灌注損傷時(shí)，其體內(nèi)炎性反應(yīng)顯著增強(qiáng)，進(jìn)而引起腎小管細(xì)胞凋亡明顯增多，導(dǎo)致腎功能受損。

綜上所述，NLRP3與大鼠腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，右美托咪定可能通過降低NLRP3表達(dá)，改善炎癥及細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎缺血再灌注損傷。