何美珊，丁楠，盧承蓉，上官文丹，鐘青萍*

1(廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)2(華農(nóng)(潮州)食品研究院有限公司，廣東 潮州，521000) 3(廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州，521000)

細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)是細(xì)菌群體由自身分泌的胞外多聚物包裹，并緊緊黏附于物體上的一種生存模式。生物膜內(nèi)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，代謝廢物的沉積、中心區(qū)域缺氧、有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酸性環(huán)境等因素促進(jìn)生物膜中“活的非可培養(yǎng)”(viable but non-culturable state，VBNC)細(xì)菌的形成，導(dǎo)致與浮游細(xì)胞相比，生物膜內(nèi)的細(xì)菌更難以被抗生素清除[1-2]。單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)為革蘭氏陽性菌，是一種重要的食源性致病菌，能引起人類和動(dòng)物嚴(yán)重的疾病，致死率較高(16%～38%)[3]。目前李斯特菌導(dǎo)致的疾病呈逐年上升的趨勢(shì)，在德國(guó)，2016年李斯特菌致死率達(dá)7%，是幾種常見腸道致病菌中引起死亡人數(shù)最高的細(xì)菌[4]。2018年南非爆發(fā)李斯特菌感染疫情，共915例感染，180人死亡。在國(guó)內(nèi)，根據(jù)歷年李斯特菌病的統(tǒng)計(jì)，1999年～2014年李斯特菌病的病例數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)，特別是新生兒感染者或中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染者病情嚴(yán)重，死亡率較高[5]。李斯特菌可在低溫下生長(zhǎng)，而且其形成的生物膜難以從食品加工設(shè)施中根除[6]。但目前對(duì)生物膜的研究主要集中于常溫下形成的生物膜，對(duì)低溫下生物膜中致病菌的生存機(jī)制的研究還比較欠缺。

目前國(guó)內(nèi)外控制生物膜的方法主要有采用抗生素、酸性和堿性消毒劑、氧化劑、植物精油、中草藥、超聲波、等離子體和酸性電解水等進(jìn)行處理[7-14]。但因價(jià)格等方面問題，在食品加工中，大多仍使用乳酸、次氯酸鈉、過氧化氫等消毒劑進(jìn)行殺菌處理，但并不能完全清除生物膜。而作為常規(guī)抗生素替代品的植物精油是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)，是食品防腐保鮮的新型天然抗菌劑。目前發(fā)現(xiàn)薰衣草精油對(duì)多種真菌和細(xì)菌都有抑制作用，其可作用于細(xì)菌的不同部位，如細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸[15-16]。84消 毒液是食品行業(yè)最常用的消毒劑之一。但目前有關(guān)薰衣草精油和84消毒液對(duì)單增李斯特菌生物膜清除效果的研究較少，因此本研究首先考察單增李斯特菌在32 ℃和10 ℃下生物膜的形成情況，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析不同濃度的薰衣草精油和84消毒液對(duì)其形成的生物膜的清除效果，并探究低溫環(huán)境對(duì)單增李斯特菌生物膜抗性的影響，對(duì)控制單增李斯特菌，消除其殘留，保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單增李斯特菌ATCC19115，購(gòu)于廣東微生物菌種保藏中心；腦心浸液肉湯(brainheart infusion broth, BHI)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；薰衣草精油(純度99%)，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司；84消毒液，藍(lán)月亮(中國(guó))有限公司；2×SGExcel FastSYBR mixture(plus)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；疊氮溴化丙錠(propidium monoazade，PMA)，美國(guó)Biotium公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC酶標(biāo)儀，Thermo公司；650W鹵鎢燈，德國(guó)Osram公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

單增李斯特菌接種于BHI培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h后，4 ℃ 4 000 r/min離心15 min收集菌體，以無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL待用。

1.3.2 生物膜的形成及其測(cè)定

1.3.2.1 生物膜的培養(yǎng)和生物量的測(cè)定

生物膜的培養(yǎng)和定量檢測(cè)參考BRENDA等的方法[17]，具體步驟如下：在無菌12孔板中垂直放置無菌玻璃片(20 mm×20 mm)，將菌懸液與BHI按1∶4體積比混勻后再按5 mL/孔加入到12孔板中，菌初始濃度為107CFU/mL。將孔板在32 ℃及10 ℃分別孵育1 d及30 d，定期測(cè)定生物膜的形成量。

采用結(jié)晶紫染色法(crystal violet staining,CV法)測(cè)定生物膜的形成量，將附著生物膜的玻璃片用10 mL 無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffersalino,PBS)洗滌3次去除浮游細(xì)胞。65 ℃干燥固定30 min，并在室溫下用5 mL 0.1%結(jié)晶紫染色30 min。用無菌蒸餾水清洗3次。干燥后，溶解于5 mL 33%乙酸中，以酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處的吸光度。

1.3.2.2 生物膜的代謝活性測(cè)定

采用XTT法，將形成生物膜的玻璃片轉(zhuǎn)移至含有5顆玻璃珠和10 mL PBS的無菌離心管中，使用渦旋劇烈振蕩2 min，將生物膜細(xì)胞收集在無菌的10 mL離心管中。在96孔板中每孔中加入100 μL生物膜懸液，然后將XTT溶液和甲萘醌溶液按12.5∶1(體積比)混合后，每孔加入50 μL，37 ℃避光孵育4 h，在450 nm下測(cè)定吸光值。

1.3.3 PMA-qPCR測(cè)定活菌數(shù)

1.3.3.1 PMA處理菌體及DNA模板的制備

取0.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，加入終濃度為40 μmol/L的PMA，充分混勻，黑暗孵育5 min，然后置于冰上，距離650 W鹵鎢燈20 cm曝光5 min，離心(8 000 r/min，2 min)收集菌體，加入40 g/L溶菌酶37 ℃處理1 h，用試劑盒提取模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的單增李斯特菌的hly基因，在保守區(qū)域用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物序列(5’→3’)GGTGGCTCCGCAAAAGATGAAG,下游引物序列(5’→3’)AGGCAATGGGAACTCCTGGTGT，由上海生工有限公司合成。

1.3.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL， 上下游引物各0.5 μL(終濃度20 μmol/L)，DNA模版5 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、3 min； 95 ℃、10 s，56 ℃、40 s；72 ℃、40 s；39個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 ℃保持5 min。熔解曲線：65～95 ℃， 升溫速率為0.5 ℃/s。

1.3.4 可培養(yǎng)菌數(shù)的測(cè)定

采用稀釋平板法測(cè)定可培養(yǎng)菌數(shù)。吸取100 μL經(jīng)過稀釋的菌液，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋濃度均設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.5 不同制劑對(duì)不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的作用

1.3.5.1 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

用96孔板微量稀釋法測(cè)定84消毒液、薰衣草精油的最小抑菌濃度。將84消毒液、薰衣草精油以MH肉湯培養(yǎng)基2倍稀釋成8個(gè)梯度。每個(gè)孔中加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，第一個(gè)孔中加入100 μL制劑混勻，然后吸取100 μL至第2孔，混勻后再吸取100 μL到第3個(gè)孔，以此類推到第8孔，從第8孔吸取100 μL棄去，再在每個(gè)孔中加入100 μL菌液，使菌液的終濃度是107CFU/mL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。在32 ℃培養(yǎng)24 h， 用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)定OD值。

1.3.5.2 測(cè)定2種制劑對(duì)成熟生物膜的清除作用

12孔板中菌液的初始濃度為107CFU/mL,將玻璃片置于其中，分別在32 ℃及10 ℃孵育12 h及19 d， 使其成熟生物膜得到相同活菌數(shù)，把成熟生物膜取出用PBS清洗2次，棄去浮游菌，放入無菌培養(yǎng)皿中，分別加入不同濃度(1/2、1、2、4 MIC)的制劑5 mL， 分別在10和32 ℃處理0.5、1、2、3、6 h，按照上述方法測(cè)定生物膜生物量和代謝活性的變化，以及活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)，并計(jì)算清除率，如公式(1)所示。

(1)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行方差分析，并以最小顯著差(least significant difference，LSD)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下單增李斯特菌生物膜的形成

由圖1-A所示，單增李斯特菌在32 ℃下培養(yǎng)16 h后，形成的生物膜總量最多，代謝最旺盛，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，生物膜總量和代謝活性也隨之減少，結(jié)果表明，單增李斯特菌生物膜在32 ℃、16 h后達(dá)到成熟。圖1-B表明，單增李斯特菌在10 ℃下第19天時(shí)生物量以及代謝活性最大。取單增李斯特菌在32 ℃、12 h和10 ℃、19 d下的生物膜計(jì)算活菌數(shù)，結(jié)果分別為(8.81±0.42)lg CFU/cm2、(9.09±0.05)lg CFU/cm2，通過T檢驗(yàn)沒有顯著差異。

2.2 薰衣草精油對(duì)不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的清除作用

經(jīng)測(cè)定薰衣草精油對(duì)單增李斯特菌的MIC值為1.6%(體積分?jǐn)?shù))。采用1/2、1、2、4 MIC的薰衣草精油處理10 ℃和32 ℃形成的生物膜，結(jié)果表明，隨著薰衣草濃度和處理時(shí)間的增加，對(duì)生物膜的清除作用逐漸增強(qiáng)，4 MIC的薰衣草精油處理3 h時(shí)對(duì)32 ℃生物膜的生物量清除率和代謝活性的減少率分別為82%和73%，對(duì)低溫生物膜的清除作用為56%和50%(圖2)。

A-32 ℃；B-10 ℃圖1 不同溫度下單增李斯特菌的生物膜的形成Fig.1 Biofilm formation of L. monocytogenes at different temperatures

A-32 ℃生物膜的生物量清除率；B-32 ℃生物膜的代謝活性減少率；C-10 ℃生物膜的生物量清除率；D-10 ℃生物膜的代謝活性減少率圖2 薰衣草精油對(duì)32 ℃和10 ℃下形成的單增李斯特菌生物膜的作用Fig.2 Effects of lavender essential oil on L. monocytogenes biofilm formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.3 84消毒液對(duì)不同溫度下形成的單增李斯特菌生物膜的清除作用

經(jīng)測(cè)定84消毒液對(duì)單增李斯特菌的MIC值為2.5%(體積分?jǐn)?shù))。采用1/2、1、2、4 MIC的84消毒液處理10 ℃和32 ℃形成的生物膜，結(jié)果顯示，隨著84消毒液濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，清除率逐漸增加，4 MIC處理32 ℃生物膜3 h時(shí)，生物量和代謝清除率為78%和60%，對(duì)10 ℃生物膜的清除率為56%和48%。低溫生物膜的抗性更強(qiáng)。兩種制劑對(duì)常溫生物膜的清除能力均比低溫生物膜效果顯著(圖3)。

A-32 ℃生物膜的生物量清除率；B-32 ℃生物膜的代謝活性減少率；C-10 ℃生物膜的生物量清除率；D-10 ℃生物膜的代謝活性減少率圖3 84消毒液對(duì)32 ℃和10 ℃下形成的單增李斯特菌生物膜的作用Fig.3 Effects of 84 disinfectant on L. monocytogenes biofilm formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.4 不同制劑處理對(duì)不同溫度下形成的生物膜細(xì)胞的影響

采用4種濃度的薰衣草精油和84消毒液處理兩種溫度下形成的單增李斯特生物膜3 h，活菌數(shù)和可培養(yǎng)數(shù)如圖4所示。

經(jīng)過薰衣草精油處理后，32 ℃生物膜較10 ℃生物膜的菌數(shù)下降明顯，4 MIC處理下，32 ℃生物膜活菌數(shù)減少6.35 lg CFU/cm2，可培養(yǎng)數(shù)減少9.01 lg CFU/cm2。低溫生物膜處理前活菌數(shù)為9.09 lg CFU/cm2，可培養(yǎng)菌數(shù)為5.78 lg CFU/cm2，約有3.32 lg CFU/cm2細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)；經(jīng)4 MIC薰衣草精油處理后活菌數(shù)為5.94 lg CFU/cm2，減少了3.16 lg CFU/cm2，可培養(yǎng)數(shù)為3.85 lg CFU/cm2，減少了1.93 lg CFU/cm2，仍存有VBNC細(xì)胞。4 MIC濃度處理下，10 ℃生物膜中殘留更多的活菌和VBNC細(xì)胞(圖4-A)。圖4-B顯示，4 MIC的84消毒液處理后，32 ℃生物膜中生物膜活菌減少量為3.68 lg CFU/cm2，而10 ℃生物膜減少量約2.88 lg CFU/cm2。薰衣草精油比84消毒液對(duì)生物膜中活菌數(shù)的減少更加顯著。

A-薰衣草精油；B-84消毒液圖4 兩種制劑對(duì)兩種溫度下形成的單增李斯特菌生物膜細(xì)胞的影響Fig.4 Effects of two agents on L. monocytogenes cells in biofilms formed at two temperatures

3 討論

本研究考察了32 ℃和10 ℃下單核細(xì)胞增生李斯特菌的生物膜的形成，并分析了2種制劑對(duì)其成熟生物膜的清除作用。選擇32 ℃主要為該菌的適宜生長(zhǎng)溫度且為夏季常見溫度。另外，果蔬及肉制品通常儲(chǔ)存于0～4 ℃，但實(shí)際上，在冷藏條件和運(yùn)輸過程中，溫度可能升高至10 ℃[18]。基于單增李斯特菌能耐低溫，因此本研究亦考察10 ℃低溫對(duì)其生物膜形成及其抗性的影響。

DI BONAVENTURA等[19]發(fā)現(xiàn)與聚苯乙烯、不銹鋼相比，在玻璃表面上單增李斯特菌在4、12和22 ℃更易形成生物膜，而在37 ℃時(shí)，在不銹鋼和玻璃表面上能形成相當(dāng)量的生物膜。玻璃為食品加工及儲(chǔ)藏中常見的接觸面，因此本研究在玻璃面上考察不同溫度下單增李斯特菌生物膜的形成特性，研究結(jié)果表明，單增李斯特菌在低溫下能形成穩(wěn)定的生物膜，但生物膜量顯著低于32 ℃，在32 ℃時(shí)單增李斯特菌能更快形成生物膜。這可能是由于溫度升高細(xì)胞生長(zhǎng)加快，而且細(xì)胞疏水性隨溫度升高而增加，從而增強(qiáng)了細(xì)胞黏附能力[20]。此外，鞭毛是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)所必須的，與生物膜形成密切相關(guān)，VATANYOOPAISARN等[21]發(fā)現(xiàn)單核增生李斯特菌的運(yùn)動(dòng)性在較低溫度下急劇下降，可能導(dǎo)致細(xì)胞附著量較低，形成的生物膜較少。然而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，單增李斯特菌在10 ℃下培養(yǎng)19 d時(shí)生物膜活菌數(shù)為(9.09±0.05)lg CFU/cm2，表明其在低溫下能長(zhǎng)期存活并形成生物膜。

本研究以不同濃度的薰衣草精油和84消毒液處理單增李斯特菌在32 ℃和10 ℃下形成的成熟生物膜，采用結(jié)晶紫法和XTT法分析其對(duì)生物膜清除的效果。結(jié)果表明，隨著濃度和處理時(shí)間的增加，薰衣草精油和84消毒液對(duì)生物膜的代謝活性和生物量清除效果逐漸增強(qiáng)，但對(duì)32 ℃生物膜的效果優(yōu)于對(duì)10 ℃下形成的生物膜(圖2和圖3)。低溫下形成的生物膜對(duì)防腐消毒劑的耐受性的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

為分析其抗性，本研究首先測(cè)得32 ℃孵育12 h與10 ℃孵育19 d的生物膜具有相當(dāng)?shù)幕罹鷶?shù)，以此為材料進(jìn)一步定量評(píng)估薰衣草精油和84消毒液對(duì)兩種溫度下形成的生物膜中細(xì)菌的殺滅能力，分別測(cè)定處理3 h后的可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)?？偟膩碚f，10 ℃生物膜對(duì)兩種制劑的敏感性比32 ℃下形成的生物膜更低。PUGA等[22]以殼聚糖處理20 ℃和4 ℃形成的單增李斯特菌生物膜，發(fā)現(xiàn)4 ℃形成的生物膜更薄但對(duì)殼聚糖的抗性更強(qiáng)，可能是在低溫形成的膜基質(zhì)致密性增加從而影響殼聚糖滲透。細(xì)菌VBNC狀態(tài)是指其不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，但仍具有活性，并可在適宜條件下復(fù)蘇的特殊狀態(tài)[23]，與正常細(xì)胞相比，VBNC細(xì)胞表現(xiàn)出比可培養(yǎng)的細(xì)胞更低的代謝活性，能繼續(xù)保持膜完整性。我們發(fā)現(xiàn)，在低溫形成的生物膜中，約有1/3的單增李斯特菌細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)，這可能與低溫生物膜對(duì)防腐消毒劑的抗性增強(qiáng)密切相關(guān)。NOWAKOWSKA等[24]發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)的VBNC創(chuàng)傷弧菌具有更強(qiáng)的對(duì)熱、氧化應(yīng)激、滲透壓、pH、乙醇、重金屬和抗生素的耐受性。

薰衣草精油主要成分為乙酸芳樟酯和芳樟醇，CHERRAT等[25]以5種精油分別處理單增李斯特菌和大腸桿菌280 min或24 h后，使用熒光探針監(jiān)測(cè)細(xì)菌的膜流動(dòng)性和完整性，發(fā)現(xiàn)香薄荷精油和月桂精油能使細(xì)胞膜表面硬化，可滲透在細(xì)胞質(zhì)膜中與膜中存在的蛋白質(zhì)相互作用并擾亂它們的功能。DI PASQUA等[26]研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌可以改變膜脂肪酸組成，以抵消精油活性成分對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響，從而維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。

84消毒液的主要成分為次氯酸鈉，次氯酸鈉是食品工業(yè)中常用的消毒劑,在水中形成次氯酸，其主要作用機(jī)理為次氯酸能與質(zhì)粒DNA直接反應(yīng)導(dǎo)致雙鏈斷裂，以及侵入細(xì)胞內(nèi)部與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用[27-28]。徐冬旸等[29]研究表明，常規(guī)濃度的84消毒液處理可抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，而LEE等[30]研究發(fā)現(xiàn)游離氯只能使外部生物膜失活，而內(nèi)部生物膜不受游離氯的影響，游離氯不能完全滲透生物膜。NORWOOD[31]以1 000 mg/L的次氯酸鈉處理單增李斯特菌生物膜20 min， 結(jié)果可培養(yǎng)細(xì)胞減少2 lg CFU/mL，而去除相同量的浮游細(xì)胞僅需要10 mg/L的次氯酸鈉。VBNC細(xì)胞的低呼吸活動(dòng)意味著與細(xì)胞外環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)和能量交換減少，使其在饑餓壞境及氯和氯胺消毒中存活[32]。本研究發(fā)現(xiàn)84消毒液和薰衣草精油處理0.5～1 h對(duì)32 ℃生物膜與10 ℃生物膜的清除效果差異不大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)32 ℃生物膜的清除作用高于10 ℃生物膜。薰衣草精油對(duì)32 ℃生物膜活菌的清除能力高于84消毒液，而2種制劑對(duì)10 ℃生物膜活菌的清除效果相差不大。2種制劑均能誘導(dǎo)部分生物膜細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)，使平板計(jì)數(shù)結(jié)果遠(yuǎn)低于活菌數(shù)。低溫生物膜可增強(qiáng)單增李斯特菌對(duì)防腐消毒劑的抗性，需增加劑量或延長(zhǎng)處理時(shí)間才能有效清除生物膜細(xì)胞。