張璟琳，張璐，賈雪穎，黃明泉*，孫寶國

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津,300457)2(北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京,100048)

氯丙醇酯(bound monochloropropanediol，MCPDE)是氯丙醇(monochloropropanediol，MCPD)連接不同高級(jí)脂肪酸后產(chǎn)生的酯類化合物[1]。2004年SVEJKOVSKA等[2]發(fā)現(xiàn)食品中含有高含量的氯丙醇酯。隨后氯丙醇酯在多種食用油[3-4]，油脂[5]和高油脂食品[6]，甚至在嬰兒奶粉中被檢測(cè)到[7]。氯丙醇酯本身具有一定毒性[8]，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)顯示，氯丙醇酯可通過腸道內(nèi)的脂肪酶水解成氯丙醇[9-10]產(chǎn)生毒性。熱反應(yīng)的過程會(huì)產(chǎn)生低劑量的氯丙醇酯等毒性物質(zhì)[11]，所以對(duì)氯丙醇酯在食品中的含量進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)人們的身體健康十分重要。

目前，氯丙醇酯的研究多集中于油脂精煉加工[4,12]過程中，國內(nèi)外對(duì)于食品中氯丙醇酯的研究相對(duì)少[13-14]。SVEJKOVSKA等[2]發(fā)現(xiàn)在一些奶酪、黑麥芽、烤花生、臘腸、和烤雞中3-MCPDE含量較高(0.14～6.10 mg/kg)；KüSTERS等[14]采用GC-MS檢測(cè)了高油脂食品(如烘焙食品，甜食，肉汁，湯粉，食用油)中MCPDE含量，其中含量最高為人造黃油樣品，為1 417 μg/kg；里南[15]對(duì)我國的食用油、方便面和油炸食品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，油炸食品中氯丙醇酯的污染較為嚴(yán)重，3-MCPDE和2-MCPDE的含量為0.064～7.67 mg/kg脂肪和0.072～5.02 mg/kg脂肪。

油炸作為高溫下油脂直接接觸食品的一種加工方式，很可能導(dǎo)致最終食品中含有較高含量的氯丙醇酯，對(duì)人體健康造成一定的風(fēng)險(xiǎn)。國內(nèi)雖對(duì)油炸食品中3-MCPDE和2-MCPDE含量多有分析，但是對(duì)脂肪提取部分的優(yōu)化不足。國外研究者[16-17]使用加速溶劑萃取的方式提取食品中的氯丙醇酯。超聲波儀器屬于實(shí)驗(yàn)室的常用儀器，對(duì)很多物質(zhì)提取有重要作用[18]，通過優(yōu)化超聲波提取的條件，經(jīng)過前處理及GC-MS/MS分析進(jìn)而確定3-MCPDE和2-MCPDE的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：油餅(編號(hào)1)，菜丸子(編號(hào)2)，麻花(編號(hào)3)，蝦片(編號(hào)4)，炸花生(編號(hào)5)，馓子(編號(hào)6)，鍋巴(編號(hào)7)，咯吱盒(編號(hào)8)，炸魚(編號(hào)9)，炸羊肉丸(編號(hào)10)，炸雞肉(編號(hào)11)，麻花(編號(hào)12)，超市。

試劑：叔丁基甲基醚(t-butyl methyl ether, TBME)，乙醚，乙酸乙酯，正己烷，NaOH，石油醚，甲醇，四氫呋喃(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H3PO4，苯硼酸，異辛烷(均為分析純)，百靈威科技有限公司。

3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, pp-3-MCPD)，d5-3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(d5-1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, d5-pp-3-MCPD)，2-氯-1,3-丙二硬脂酸酯(1,3-distearoyl-2-chloropropanediol, pp-2-MCPD)，均為標(biāo)準(zhǔn)品，純度>97%，Toronto Research Chemicals公司。

溶液配制：pp-3-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至10.0 μg/mL；pp-2-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至10.0 μg/mL；d5-pp-3-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至5.0 μg/mL；甲醇鈉溶液，0.25 gNaOH溶解于100 mL甲醇中，搖勻至全部溶解，放置于-22 ℃冰箱中；NaBr溶液，600 g NaBr加入3.0 mL H3PO4定容于1.0 L水中，移取600 μL，加入350 μL甲醇鈉溶液，放置于-22 ℃冰箱中；乙醚/乙酸乙酯溶液，將30 mL乙醚與20 mL乙酸乙酯混合放置于存儲(chǔ)瓶中；苯硼酸溶液，稱取200 mg苯硼酸溶解于10 mL丙酮中。

1.2 儀器與設(shè)備

T-403電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Pipetman M EF9697精密移液器，法國Gilson公司；TSQ8000三重串聯(lián)四級(jí)桿氣相質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x，北京八方世紀(jì)科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JYL-C012食物打碎機(jī)，九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總脂肪含量測(cè)定

總脂肪含量的檢測(cè)參照GB/T 5009.6—2016[19]并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取5.00 g樣品，移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入脂肪提取器的抽提筒中，連接已干燥的250 mL抽提瓶，由冷凝管上端加入190 mL石油醚，于油浴鍋內(nèi)100 ℃加熱，不斷回流提取6 h。反應(yīng)結(jié)束后取下接收瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸發(fā)，再于(100±5) ℃干燥2 h，放干燥器中冷卻0.5 h后稱重，重復(fù)操作直至恒重。

1.3.2 樣品前處理

MCPDE提取(油脂提取物)：將試樣均勻打碎，稱取試樣5.00 g，加入20 mL TBME，充分振搖混勻，40 ℃超聲提取20 min，以3 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移出上層溶劑。下層樣品重復(fù)提取(1次)，合并有機(jī)相，以氮?dú)鉂饪s至質(zhì)量不再減少。

MCPDE的酯化及衍生[20]：稱取100 mg油脂提取物，加入80 μL內(nèi)標(biāo)物d5-pp-3-MCPD，600 μL乙醚，搖晃至溶解。油脂提取物在-22～-25 ℃保持15 min，加入350 μL甲醇鈉溶液，于-22 ℃反應(yīng)16 h。取出反應(yīng)液，加入600 μL NaBr溶液于-22 ℃停止反應(yīng)，氮吹。加入正己烷600 μL，劇烈搖，在室溫下靜置5 min。 用吸管移去有機(jī)相，再用600 μL正己烷清洗1次，移去有機(jī)相。用600 μL乙醚/乙酸乙酯溶液提取3次，轉(zhuǎn)移有機(jī)相并用無水Na2SO4除水，加入80 μL衍生溶液，常溫超聲5 min，氮吹至干，用500 μL的異辛烷復(fù)溶。

1.3.3 儀器分析條件

(1)氣相色譜條件

HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初溫60 ℃，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；載氣He，純度99.999%，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

(2)質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，選擇反應(yīng)掃描模式(selective reaction monitoring，SRM)參數(shù)如表1所示。

表1 MCPDEs的保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 retention times and m/z of native and stable isotopelabelled MCPDEs for GC-MS/ MS SRM analysis

1.4 總脂肪及氯丙醇酯含量計(jì)算

(1) 總脂肪含量計(jì)算，見公式(1)。

(1)

式中：x，試樣中粗脂肪含量，g/100g;m1，接收瓶和粗脂肪的總質(zhì)量, g;m0，接收瓶的質(zhì)量, g;m2，試樣的質(zhì)量, g。

(2)氯丙醇酯的含量

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：3-MCPDE和2-MCPDE的定量結(jié)果均以游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD，換算系數(shù)如表2所示。以pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)與d5-pp-3-MCPD的峰面積比與相對(duì)應(yīng)的pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程(見公式(2))。

y=a×x+b

(2)

式中：y，標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比;a，擬合曲線的斜率;b，擬合曲線的截距;x，pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的質(zhì)量(以MCPD計(jì))，μg。

樣品中pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的含量計(jì)算(以MCPD計(jì)，μg)，見公式(3)。

(3)

式中:w，樣品中pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的含量，μg/g；x/100，pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)在油脂提取物中的含量，μg/mg，100是提取的質(zhì)量,mg；m油，油脂提取物含量，mg；w樣，稱取的樣品質(zhì)量，g。

表2 MCPDE及其同位素折算系數(shù)Table 2 Conversion coefficient of MCPDE and d5-MCPDE

2 結(jié)果與分析

2.1 MCPDE提取優(yōu)化

為保證MCPDE在分析時(shí)不受到食品復(fù)雜基質(zhì)干擾，先要進(jìn)行脂肪提取。為使提取過程更加完全，需要對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。提取過程的主要優(yōu)化參數(shù)包含有機(jī)溶劑的種類和提取的溫度。溶劑的選擇是重要因素之一，因?yàn)椴煌軇?duì)目標(biāo)物的萃取效率不一樣；同時(shí)，需要避免引入氯離子，氯離子的存在可能會(huì)造成副反應(yīng)。有研究者認(rèn)為叔丁基甲基醚(TBME)被認(rèn)為是最適合的溶劑[21]，然而MA等[22]認(rèn)為TBME與乙酸乙酯在體積比為1∶5混合時(shí)提取效果更好，因?yàn)榛旌先軇┑臉O性不同，可以增加提取效率。提取溫度也是影響提取效率的重要因素，過高的溫度會(huì)使有機(jī)溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致提取率偏差較大；同時(shí)，高溫可能引起一些副反應(yīng)。過低的溫度會(huì)導(dǎo)致提取不完全，提取率低。所以，選擇40 ℃和60 ℃兩個(gè)提取溫度進(jìn)行優(yōu)化。最優(yōu)條件根據(jù)脂肪提取率和MCPDE含量結(jié)果確定，結(jié)果如圖1、圖2所示。

1-40 ℃ TBME; 2-60 ℃ TBME;3-40 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2);4-60 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2)圖1 不同超聲提取條件下脂肪提取率的比較Fig.1 Comparison of different extraction protocols based on ultrasonic extraction technique for fat recovery from the fried dough twist

1-40 ℃ TBME；2-60 ℃ TBME；3-40 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2)；4-60 ℃正己烷:TBME(體積比1∶2)圖2 不同超聲提取條件下MCPDEs含量的比較Fig.2 MCPDEs content measured in fried dough twist with different extraction protocols

以麻花(編號(hào)12)作為優(yōu)化樣品，根據(jù)國標(biāo)方法測(cè)定其脂肪含量為31.5%。在4種提取條件中，在40 ℃條件下，正己烷∶TBME=1∶2(體積比)的提取效率最高，40 ℃ TBME提取效率次之，而在60 ℃條件下，提取效率較低。可見，40 ℃提取效率高于60 ℃的提取效率，這可能是由于在提取過程中，高溫使有機(jī)溶劑揮發(fā)過多，提取效率下降。在溶劑的選擇上，正庚烷與TBME因其極性不同，溶劑混合后提取效果更好。

另外，MANIRAKIZA等[23]認(rèn)為正己烷與丙酮(體積比4∶1)混合時(shí)對(duì)樣品中總脂肪的提取最好，但是SAMARAS等[24]指出這種溶劑組合的方式提取會(huì)將含水量高食品中的水分一同提取出來，不利于后面氯丙醇酯的分析。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的有效性，對(duì)比不同超聲提取條件下MCPDE檢測(cè)的含量結(jié)果，如圖2所示。

由圖2可知，40 ℃提取溶劑為MTBE時(shí)提取效率最高，3-MCPDE含量為12.695 mg/kg，2-MCPDE含量為9.183 mg/kg。所以，選擇40 ℃，MTBE為溶劑對(duì)油炸食品進(jìn)行提取。

2.2 MCPDE檢測(cè)方法驗(yàn)證

選取9個(gè)不同質(zhì)量濃度分別建立3-MCPDE和2-MCPDE 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表3可知，2條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.992，線性良好；以信噪比(S/N)=3確定3-MCPDE和2-MCPDE的檢出限(LOD)為0.006 8 μg/g和0.0062 μg/g，以信噪比(S/N)=10確定定量限(LOQ)為0.026 μg/g和0.012 μg/g。

檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度可以通過添加已知含量的標(biāo)準(zhǔn)物來確定。在咯吱盒(編號(hào)8)中加入2種不同質(zhì)量濃度的pp-3MCPD和pp-2-MCPD，質(zhì)量濃度分別為0.11 mg/L 和0.086 mg/L，0.22 mg/L和0.17 mg/L，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣6次確定方法的重復(fù)性，分析結(jié)果如表4所示。由表4可知，兩種氯丙醇酯的回收率為93.8%～111.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～4.8%。

表3 MCPD的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限及檢出限結(jié)果Table 3 Standard curves, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of MCPDs

表4 MCPD的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The accuracy and relative standard deviation of MCPDs

注：an=6；bd5-pp-3-MCPD作為內(nèi)標(biāo)物。

2.3 油炸食品中MCPDEs含量分析

根據(jù)上述的檢測(cè)方法，分析中國油炸食品中3-MCPDE 和2-MCPDE的含量，每個(gè)分析樣品平行進(jìn)行3次，檢測(cè)結(jié)果如表5所示。

由表5可知，在檢測(cè)的12個(gè)樣品中，油脂的含量為8.1%～38.9%，3-MCPDE的含量為0.056～0.672 μg/g， 2-MCPDE的含量為ND～0.424 μg/g，其中3-MCPDE含量最高的樣品為蝦片(樣品4)，最低的為炸花生(樣品5)，2-MCPDE的含量最高的為麻花(樣品12)，最低的為炸花生(樣品5)。

表5 油炸食品中3-MCPDE和2-MCPDE的含量Table 5 Levels of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in fried foods in China

注：40 ℃TBME提??；b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；cND表示未檢出。

3 結(jié)論

以TBME為溶劑，選擇40℃超聲提取食品中的油脂部分，采用低溫下堿水解的方式檢測(cè)提取物中3-MCPDE及2-MCPDE的含量。該方法的內(nèi)標(biāo)定量曲線的線性，方法的回收率和重復(fù)性良好。在所有樣品檢測(cè)中，除了油炸花生中檢測(cè)到2-MCPDE，其他樣品均檢測(cè)到3-MCPDE及2-MCPDE；3-MCPDE含量最高的樣品為蝦片(樣品4)，2-MCPDE的含量最高的為麻花(樣品12)；在所有樣品中2-MCPDE的含量均低于3-MCPDE的含量，2-MCPDE∶3-MCPDE的含量百分比為33%～75%，但二者的比例關(guān)系的形成原因有待進(jìn)一步研究。