沈勇，劉文茹，梅俊*，謝晶*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(上海海洋大學(xué))，上海，201306) 4(食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306)

近年來，食品安全問題在全球已經(jīng)成為備受關(guān)注的問題，水產(chǎn)品由于其豐富的營養(yǎng)價值在全球范圍內(nèi)都很受歡迎[1-2]，但同時也由于其營養(yǎng)成分有利于腐敗微生物和常見的食源性疾病病原體的生長和繁殖，海產(chǎn)品的安全和營養(yǎng)價值在貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^程比肉類等其他食品下降更快[3-7]。目前，化學(xué)防腐劑是延長貨架期的主要手段之一，但由于消費(fèi)者對化學(xué)添加劑的擔(dān)憂，要求食品工業(yè)在保證產(chǎn)品的質(zhì)量的同時，少添加甚至不添加化學(xué)防腐劑，使用更多的天然防腐劑來保證食品的安全[8-11]。

微生物能夠產(chǎn)生具有抑菌性代謝產(chǎn)物，可以作為生物防腐劑抑制腐敗菌和致病菌的生長，從而達(dá)到延長食品貨架期和提高食品安全性的目的[12-13]。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的微生物(generally regarded as safe,GRAS)，在代謝中可產(chǎn)生有機(jī)酸、H2O2、細(xì)菌素等多種抑制性化合物[14-16]。乳酸菌生產(chǎn)的細(xì)菌素是由核糖體合成的蛋白質(zhì)化合物，能夠抑制多種微生物，已被證明可有效地控制病原菌和腐敗菌的繁殖[17-20]。乳酸鏈球菌素是目前市場上最重要的、也是唯一商業(yè)化的細(xì)菌素，作為一種安全、天然的食品防腐劑已被50多個國家用作食品防腐劑[14]。

在過去的研究中，從不同食物中分離出產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌及細(xì)菌素的表征進(jìn)行了廣泛的研究，然而關(guān)于魚類產(chǎn)品中存在的乳酸菌的研究較少[21]。為了延長水產(chǎn)品的貨架期，提高其品質(zhì)，選用屬于水產(chǎn)品及其加工環(huán)境中存在的乳酸菌微生物群是有利的方法，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)適應(yīng)這些環(huán)境，同時也不易產(chǎn)生一些新的氣味[22]。因此本研究旨在從花鱸魚腸道中分離出抑菌性較強(qiáng)的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，為水產(chǎn)品保鮮和天然防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

花鱸魚購買于上海蘆潮港水產(chǎn)品市場，0.5 h內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。解剖時體表完好，腸道完整，無明顯食糜。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

乳酸菌成套生化鑒定管、H2O2、革蘭氏染色液試劑盒、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯(BHI)、平板計數(shù)瓊脂(PCA)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胃蛋白酶、溴甲酚紫，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 指示菌

MGHY1、 MGHY2、MGHY3、MGHY4、MGHY5、MGHY6、MGHY7、MGHY8、MGHY9、MGHY10、MGHY11、MGHY12、MGHY13、MGHY14、MGHY15、MGHY16、MGHY17均分離自美國紅魚(經(jīng)16s鑒定后，通過NCBI比對，其最相似菌見表1)，金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26003)、金黃色葡萄球菌(CCTCC AB 91093)、金黃色葡萄球菌(實(shí)驗(yàn)室保存)、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)、大腸桿菌(實(shí)驗(yàn)室保存)、腐敗希瓦氏菌模式菌株(DSM6067)、腐敗希瓦氏菌(分離自凡納濱對蝦)、熒光假單胞菌(ATCC13525)、熒光假單胞菌(分離自三文魚)、單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC19115)、植物乳桿菌，上述菌株均由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院保存。

表1 美國紅魚中的分離菌株Table 1 Bacterial isolates from red drum

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化與初篩

參照董韓博等[23]的方法對乳酸菌進(jìn)行分離純化。無菌環(huán)境下取出花鱸魚腸道，用手術(shù)剪刀充分剪碎，加入含有25 mL的無菌生理鹽水中重復(fù)充分振蕩搖勻，制成原液，吸取1 mL用作稀釋梯度。取原液和10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六個稀釋梯度涂布于添加了溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)48～72 h，挑取能夠使平板由紫色變?yōu)辄S色的單菌落，再在添加了溴甲酚紫的MRS平板上劃線分離純化，劃線培養(yǎng)3～4次直至純化。

挑單菌落于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)18 h，再以1%接種量至MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在30 ℃下培養(yǎng)32 h，培養(yǎng)好之后離心(8 000 r/min，20 min) 取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除去菌體，得到無細(xì)胞上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用牛津杯法對乳酸菌進(jìn)行初篩[24]。在BHI液體培養(yǎng)基中分別接種大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)，30 ℃條件下培養(yǎng)12 h之后，吸取1mL用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取100 μL稀釋度為10-3的菌液均勻涂布在PCA平板培養(yǎng)基中，再在無菌條件下將牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm)均勻放置在平板上，稍微輕輕下壓，使其與平板培養(yǎng)基接觸面無空隙，然后吸取200 μL發(fā)酵液于杯中， 30 ℃下培養(yǎng)18 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈，挑選抑菌圈最大的乳酸菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

(1)排除有機(jī)酸的干擾

在酸性條件下，細(xì)菌素的抑菌活性較強(qiáng)，因此為了排除有機(jī)酸的干擾，用pH值相同的乳酸和乙酸溶液分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，設(shè)3組平行[25]。根據(jù)用pH值相同的乳酸和乙酸溶液得出的抑菌圈直徑的大小來判斷是否存在其他抑菌活性物質(zhì)。

(2)排除H2O2的干擾

用6 mol/L NaOH和6 mol/L HCl溶液將獲得的乳酸菌菌株的發(fā)酵液調(diào)節(jié)至H2O2酶最適的pH值之后，添加過氧化氫酶至終質(zhì)量濃度為1 g/L，37 ℃下溫育1 h，再將pH值調(diào)回原始pH值進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，并以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為對照。若酶解后的上清液抑菌圈未顯著減小，則說明發(fā)酵液中存在其他抑菌物質(zhì)。

(3)蛋白類抑菌物質(zhì)的確定

用6 mol/L NaOH和6 mol/L HCl將獲得的乳酸菌菌株的發(fā)酵液分別調(diào)節(jié)至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K的最適pH值(胰蛋白酶8.00、胃蛋白酶2.00、 蛋白酶K 8.00)之后，在37 ℃下溫育1 h，再將pH值調(diào)回原始pH值進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。并以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為對照。若酶解后的上清液抑菌圈顯著減小，則說明抑菌物質(zhì)為蛋白類。

1.2.3 菌株的鑒定

(1)生理生化鑒定

根據(jù)乳酸菌成套生化鑒定管試劑說明書對菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

(2)16S rDNA鑒定

將乳酸菌菌株用MRS肉湯培養(yǎng)基活化之后，培養(yǎng)至對數(shù)期，使用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA。利用提取的乳酸菌基因組DNA為模板，采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)，對乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進(jìn)行測序。

(3)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序所得的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對分析，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 抑菌譜的測定

采用牛津杯法測定產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌譜，利用1.1.3中的菌體作為指示菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與初篩

從花鱸魚的腸道中，共分離出18株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的疑似乳酸菌菌株。將初篩得到的菌株，以大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)為指示菌，用牛津杯法進(jìn)行抑菌發(fā)現(xiàn)，編號為HL7的疑似乳酸菌菌株對大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)的抑菌圈明顯。因此，選用HL7為后續(xù)研究菌株。

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

乳酸菌在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生有機(jī)酸、H2O2、細(xì)菌素等多種抑制性化合物，通過用pH值相同的乳酸和乙酸溶液以及經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液的抑菌直徑與未經(jīng)過處理的發(fā)酵液抑菌直徑進(jìn)行比較來判斷HL7菌株為產(chǎn)生細(xì)菌素菌株。由表2可見，與發(fā)酵液相同pH值的乳酸和乙酸溶液沒有抑菌作用，由此可判斷發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)不是有機(jī)酸。酸排除試驗(yàn)之后，經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液抑菌性僅僅下降10%，所以H2O2不是主要的抑菌物質(zhì)。用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K處理發(fā)酵液進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胰蛋白酶處理的發(fā)酵液抑菌圈未明顯減小，但經(jīng)胃蛋白酶和蛋白酶K處理之后的發(fā)酵液沒有抑菌性，由此可以推測該抑菌物質(zhì)雖然對胰蛋白酶不敏感，但對胃蛋白酶和蛋白酶K敏感，依然可初步確定為蛋白類物質(zhì)。

表2 不同處理發(fā)酵液的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of the fermentation broth under different treatments

注：“-”表示未顯示抑菌圈。

2.3 菌株的鑒定

根據(jù)乳酸菌成套生化鑒定管試劑說明書對該菌株進(jìn)行生化鑒定，其生化鑒定結(jié)果見表3。由表3可知該菌株能夠發(fā)酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、菊糖、乳糖，不能利用棉子糖和馬尿酸鈉。該結(jié)果表明該菌株可以發(fā)酵多種糖，符合乳酸菌的特性；而七葉苷水解實(shí)驗(yàn)為陽性也初步判定該菌株為腸球菌[26]。

表3 生化鑒定結(jié)果Table 3 Results of biochemical identification

將HL7菌株利用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA之后，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行序列相似性比對，根據(jù)序列〗的比對結(jié)果，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖1可知,HL7和EnterococcusfaecalisTY1(CPO31027.1)菌株在同一分支上，序列相似性達(dá)到99%，因此該菌株命名為EnterococcusfaecalisHL7。

圖1 菌株HL7根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of HL7 constructed based on 16S rDNA sequence analysis

2.4 菌株的抑菌譜

為驗(yàn)證該菌株在海產(chǎn)品保鮮上的適用性，利用多種來源于海產(chǎn)品的腐敗菌和致病菌作為指示菌，采用牛津杯法檢測EnterococcusfaecalisHL7發(fā)酵上清液的抑菌譜。其結(jié)果表明該發(fā)酵上清液能有效抑制多種腐敗菌和致病菌，在海產(chǎn)品保鮮上具有很大潛力，抑菌結(jié)果見表4。

表4 HL7發(fā)酵上清液的抑菌譜Table 4 Inhibition spectrum of fermented supernatant of HL7

注: “ - ”表示無抑菌性; “ + ”表示抑菌圈直徑< 10 mm; “ + + ”表示抑菌圈直徑 10～15 mm; “ + + + ”表示抑菌圈直徑 15～20 mm；“ + ++ + ”表示抑菌圈直徑> 20 mm。

3 結(jié)論

經(jīng)過對樣本中的乳酸菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，本研究從花鱸魚腸道中分離得到1株乳酸菌經(jīng)16S rDNA分子鑒定并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定為Enterococcusfaecalis。通過排除有機(jī)酸和H2O2的干擾以及蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)，可以確定抑菌物質(zhì)為蛋白類活性物質(zhì)。根據(jù)該菌株發(fā)酵液抑菌譜試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對多種來源于海產(chǎn)品的腐敗菌和致病菌具有抑制作用，為其作為海產(chǎn)品生物保鮮提供了有力的支持。此外，對于Enterococcusfaecalis的細(xì)菌素還需要進(jìn)一步的研究，利用合適的方法將該細(xì)菌素進(jìn)行分離純化研究其結(jié)構(gòu)特征。