安文藝，雷佳琦，董元洋，武 威，劉 璇，邵玉新，張炳坤

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193）

肉仔雞生長快，飼養(yǎng)集約化程度高、密度大，致其免疫力低下，抗病力差，易受到各種病原菌侵襲?？股卦诟纳菩笄菝庖吡蜕a(chǎn)性能方面做出重要貢獻[1]，但抗生素在畜禽飼料中的禁用勢在必行，尋找抗生素替代物以改善畜禽免疫力成為當(dāng)今畜牧業(yè)關(guān)注的熱點。殼寡糖（Chitooligosaccharides, COS）是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中唯一堿性功能寡糖，有來源廣、分子量小、活性高等優(yōu)點，在調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系、提高機體免疫力和改善動物生長性能方面均有顯著效果。研究顯示，COS可提高肉仔雞胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)，降低腸道中大腸桿菌數(shù)，促進肉仔雞生長[2-3]。屎腸球菌（Enterococcus faeciums，PNC）是人和動物腸道菌群組成成員，可代謝產(chǎn)生有機酸、過氧化氫和細菌素等，降低腸道pH，抑制病原菌，有益生特性[4]。研究表明，PNC 可促進肉雞生長，緩解大腸桿菌和沙門氏菌導(dǎo)致的肉仔雞生產(chǎn)性能下降，并提高血清中IgA 含量，增加盲腸生物多樣性，改善腸道微生物組成[5-6]。

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組分，是免疫系統(tǒng)的有效激活劑，廣泛應(yīng)用于炎癥反應(yīng)模型構(gòu)建。研究表明，LPS 刺激降低肉仔雞生長性能，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IL-1β 等表達量上升[7-8]，COS 抑制LPS 刺激的RAW 264.7 細胞中促炎介質(zhì)如IL-1β 和NO 產(chǎn)生[9]。目前，關(guān)于COS 與PNC 聯(lián)合使用的報道較少，但已發(fā)現(xiàn)COS 可促進益生菌增殖[10]，二者同時添加或能更好地發(fā)揮益生作用。因此，本試驗用LPS 構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型，多次注射模擬細菌感染，探究COS 與PNC 對LPS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用效果，為其在肉雞飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 COS 為寡糖素COS（II），化學(xué)名稱為寡聚β-(1-4)-2- 氨基-2- 脫氧-D- 葡萄糖，聚合度2～10。寡糖素COS（II）（以下簡稱COS）產(chǎn)品是以甲殼類動物多糖為原料，采取酶法降解殼聚糖與膜分離結(jié)合技術(shù)生產(chǎn)的一種吸收性寡糖，含COS10%，載體為麥芽糊精。

PNC 為實驗室保藏雞源屎腸球菌PNC01[11]，將保藏菌種用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 代后，發(fā)酵、噴粉，以稻殼為載體，有效含量為5×1010CFU/g。

1.2 試驗動物及日糧 選取1 日齡健康且體重相近的AA公雛560 羽，采用2（LPS 刺激/非LPS 刺激）×2（添加COS/不添加COS）×2（添加PNC/不添加PNC）三因素試驗設(shè)計，共8 個處理，每處理7 重復(fù)，每重復(fù)10只雞（各籠雞平均體重為雞群平均體重±3%），試驗期21 d。試驗飼糧參照《雞營養(yǎng)需要》（NY/T 33-2004），結(jié)合《AA 肉雞飼養(yǎng)管理手冊》配制，呈粉狀，基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗飼糧分別在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加COS（200 mg/kg）和PNC（1×109CFU/kg）。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 LPS 刺激與飼養(yǎng)管理 試驗用LPS 為大腸桿菌源脂多糖，購自Sigma-Aldrich（美國），于試驗雞17、19和21 日齡早晨每只雞腹腔注射1 mg/kg BW 的LPS，對照組腹腔注射生理鹽水。

動物飼養(yǎng)試驗于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽試驗基地進行，肉仔雞3 層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，常規(guī)免疫。每天觀察溫度、濕度變化和采食情況，記錄死亡情況。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定 于試驗雞21 日齡，每重復(fù)隨機選取1 只健康且接近平均體重的雞，于腹腔注射LPS 3 h 后，稱活重，翅靜脈無菌采血，頸靜脈放血致死，分離肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺后稱重。取脾臟和回腸組織樣于2 mL RNAase free 管中，液氮速凍，-80℃保存待測。取盲腸食糜于5 mL 離心管，-80℃保存，測定短鏈脂肪酸（SCFA）含量。

1.4.1 生長性能 試驗開始，第17 天和21 天早晨以重復(fù)為單位稱取空腹重，用于生長性能的統(tǒng)計。計算階段采食量、體增重和耗料增重比（采食量/體增重）。

1.4.2 器官指數(shù) 根據(jù)肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺的重量和雞只活重，計算器官指數(shù)：器官指數(shù)=器官重（g）/宰前活重（kg）。

1.4.3 腸道組織形態(tài) 回腸組織樣品經(jīng)10%中性甲醛固定后，用石蠟包埋，制作石蠟切片，PAS 染色后進行腸道形態(tài)的觀測。用活細胞工作站進行絨毛高度和隱窩深度的測定。每個切片選取10 根完整且平直的絨毛和對應(yīng)的10 個隱窩深度，絨毛高度為絨毛頂端到隱窩入口處的垂直距離，隱窩深度為隱窩入口到絨毛基部的垂直距離。

1.4.4 血清中IgA 含量測定 翅靜脈無菌采血2 mL，4℃，3 000 r/min 離心15 min，分離所得血清-20℃保存待測。用雙抗夾心ELISA 法測定血清中IgA，試劑盒購自美國Bethyl 公司，測定方法參照說明書，血清稀釋8 000 倍測定，用ELISA calc 軟件繪制標(biāo)準曲線。

1.4.5 脾臟和回腸mRNA 表達量測定 總RNA 采用RNAiso Plus 試劑（TaKaRa，日本）提取，步驟參見Wang 等[8]。RNA 濃度和純度采用Nanodrop 2000 測定，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查其完整性，濃度、純度和完整性均符合要求的RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑（TaKaRa，日本）。操作按照試劑盒說明書進行，取910 ng RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-30 ℃保存?zhèn)溆?。qPCR 在7500 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City， California， USA）上進行，試劑為SYBR?Premix Ex Taq?（TaKaRa，日本）。PCR反應(yīng)條件參考試劑盒說明書。反應(yīng)結(jié)束后用熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳檢測表達產(chǎn)物的特異性。用2-ΔΔCt計算相對表達量，目的基因及內(nèi)參基因的引物序列見表2。

1.4.6 盲腸食糜中SCFA 含量的測定 取盲腸凍存樣品，用剪刀剪開腸壁取0.1 g 左右于10 mL 離心管，加入5 mL鹽酸甲酸混合液，200 μg 內(nèi)標(biāo)溶液，鋼珠2 顆，迅速放回；置于冰上1 h，并間歇震蕩混勻；14 000 r/min離心20 min；用2 mL 注射器吸取1 mL 左右離心上清液，通過0.2 μm 的濾膜過濾至2 mL 樣品瓶中。用氣象色譜（SCION-456-GC）檢測，使用氮氣作為載氣，流速為20 mL/min，氫氣流量為30 mL/min，空氣流量為300 mL/min。將檢測器和注射器溫度分別加熱至230℃和200℃，進樣量為2 μL，測定乙酸、丙酸和丁酸含量。結(jié)果表示為每克食糜樣品中SCFA 的微克數(shù)（μg/g）。

表2 Real-time PCR 引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007 處理后，采用SPSS 18.0 一般線性模型（GLM）分析；當(dāng)LPS 刺激、COS與PNC 處理的交互作用顯著時，做單因素方差分析，當(dāng)組間差異顯著時，采用Duncan's 結(jié)合LSD 多重比較進行分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。試驗結(jié)果用平均值和SEM（標(biāo)準誤）表示。

2 結(jié) 果

2.1 COS 和PNC 對肉仔雞生長性能的影響 由表3 可知，各處理組肉仔雞0～17 d 的生長性能無顯著差異。由表4 可知，LPS 刺激降低了肉仔雞17～21 d 采食量（P＜0.01），有提高耗料增重比的趨勢，對體增重及0～21 d 生長性能無顯著影響。添加COS 可緩解LPS 刺激下的采食量下降（P＜0.05），提高0～21 d 肉仔雞體增重（P＜0.05），有提高0～21 d 采食量并降低耗料增重比的趨勢。COS 與PNC 對0～21 d 肉仔雞的體增重和采食量交互作用顯著（P＜0.05）：在非LPS 刺激條件下，同時添加COS 和PNC 較單獨添加PNC 可提高肉仔雞體增重和采食量（P＜0.05），但刺激條件下各日糧處理組差異不顯著。LPS、COS 和PNC 三因素互作對生產(chǎn)性能無顯著影響。

2.2 COS 和PNC 對肉仔雞器官指數(shù)的影響 由表5 可知，LPS 刺激提高21 d 肉仔雞肝臟和脾臟指數(shù)（P＜0.01），對胸腺指數(shù)無顯著影響。COS 可降低21 d 肉仔雞脾臟指數(shù)（P＜0.05），PNC 可降低21 d 肉仔雞脾臟指數(shù)（P＜0.01）。LPS、COS 和PNC 三因素互作對法氏囊指數(shù)有顯著差異（P＜0.05），LPS 刺激降低肉仔雞法氏囊指數(shù)（P＜0.05），單獨或同時添加COS 和PNC 均能緩解法氏囊指數(shù)降低。

表3 COS 和PNC 對LPS 刺激前（0～17 d）肉仔雞生長性能的影響

表4 COS 和PNC 對LPS 刺激后（17～21 d）和全期（0～21 d）肉仔雞生長性能的影響

2.3 COS 和PNC 對肉仔雞腸道形態(tài)的影響 由表6 可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔雞回腸絨毛高度和隱窩深度（P＜0.01），對絨毛高度/ 隱窩深度無顯著影響；PNC 降低21 d 肉仔雞回腸隱窩深度（P＜0.05），對絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度無顯著影響；COS 及各因素互作對腸道形態(tài)無顯著影響。

表5 飼糧中添加COS 和PNC 對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響 g/kg BW

2.4 COS 和PNC 對肉仔雞血清IgA 含量的影響 由表7可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔雞血清IgA 含量（P＜0.05），COS 降低21 d 肉仔雞血清IgA 含量（P＜0.05），PNC可提高21 d 肉仔雞血清IgA 含量（P＜0.05），各因素互作對血清IgA 含量無顯著影響。

2.5 COS 和PNC 對肉仔雞脾臟和回腸mRNA 相對表達量的影響 由表8 可知，LPS 刺激提高肉仔雞脾臟和回腸IL-1β 和脾臟IL-8 mRNA 表達量（P＜0.01），降低脾臟TLR4 mRNA 表達量（P＜0.01），對NF-κB mRNA 表達量無顯著影響；COS 有降低脾臟IL-1β 表達量的趨勢（P=0.097），降低LPS 刺激后IL-8 mRNA表達量（P＜0.05）。PNC 及各因素互作對各基因表達量無顯著影響。

表6 飼糧中添加COS 和PNC 對肉仔雞回腸形態(tài)的影響

2.6 COS 和PNC 對肉仔雞盲腸SCFA 含量的影響 由表9 可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔雞盲腸食糜中丁酸含量（P＜0.05），對盲腸食糜中乙酸和丙酸含量無顯著影響。COS 提高盲腸食糜中丙酸和丁酸含量（P＜0.05），有提高乙酸含量的趨勢。LPS 和PNC 對盲腸食糜中乙酸含量交互作用顯著（P＜0.05）；非LPS 刺激條件下，同時添加COS 和PNC 增加盲腸食糜中乙酸含量（P＜0.05），LPS 刺激條件下，添加PNC 降低盲腸食糜中乙酸含量（P＜0.05）。各因素互作對丙酸和丁酸含量無顯著交互作用。

3 討 論

3.1 COS 和PNC 對肉仔雞生長性能的影響 益生菌與益生元是重要的抗生素替代物。前人研究表明，COS單獨添加及與干酪乳桿菌共同添加可顯著提高肉仔雞的平均日增重[12]。COS 的免疫調(diào)節(jié)效果以及雞源PNC的促生長效果均已經(jīng)被證實[9,11]，但同時添加COS 和PNC 的免疫調(diào)節(jié)功能有待探究。本試驗通過LPS 多次刺激肉仔雞，建立肉仔雞炎癥反應(yīng)模型，以探究COS和PNC 的免疫調(diào)節(jié)作用。LPS 刺激導(dǎo)致免疫應(yīng)激，研究表明，LPS 刺激提高肉雞肝臟的相對重量，降低體重和飼料利用率，還可影響骨骼代謝，降低脛骨重量與脛骨強度，增加骨骼的分解代謝，改變機體組成成分[13]；另外，LPS 刺激還會消耗營養(yǎng)物質(zhì)用于細胞因子等分泌，造成分解代謝增強，合成代謝減弱[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激降低肉仔雞17～21 d 采食量，COS 可以提高應(yīng)激狀態(tài)下的采食量，改善體增重，降低了LPS 對肉仔雞生長的不良影響。

表7 飼糧中添加COS 和PNC 對肉仔雞血清IgA 的影響

3.2 COS 和PNC 對肉仔雞器官指數(shù)的影響 肝臟是急性期蛋白合成的場所，脾臟則是機體重要的外周免疫器官，是免疫感應(yīng)發(fā)生的重要場所，二者相對指數(shù)增加有利于提高抗原清除速度。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 多次刺激顯著提高肉仔雞肝臟和脾臟的器官指數(shù)[7]。本試驗發(fā)現(xiàn)添加COS 和PNC 可抑制LPS 刺激后脾臟指數(shù)上升。法氏囊則是禽類特有的中樞免疫器官，可產(chǎn)生B 淋巴細胞，從而產(chǎn)生特異性抗體完成特定免疫應(yīng)答。本試驗發(fā)現(xiàn)，COS 可緩解LPS 刺激后法氏囊萎縮，這與Deng 等[15]發(fā)現(xiàn)的COS 促進法氏囊發(fā)育的報道相一致。

表8 飼糧中添加COS 和PNC 對肉仔雞脾臟mRNA 表達量的影響

3.3 COS 和PNC 對肉仔雞腸道組織形態(tài)的影響 肉仔雞生長早期，持續(xù)的LPS 刺激會降低腸道的生長速度和腸道上皮細胞的增殖速度，進而降低肉仔雞十二指腸和空腸的絨毛高度和隱窩深度，進而降低腸道的吸收能力[16]。本試驗中LPS 刺激后肉仔雞回腸形態(tài)被破壞，肉仔雞生長性能下降。一般來說，回腸更接近后腸段，pH 更高，食糜流通速度慢，更易受到微生物影響，進而通過改變SCFA 含量，尤其是丁酸含量來改變腸道形態(tài)，然而本試驗條件下COS 和PNC 沒有顯著改善LPS 造成的腸道形態(tài)改變。

3.4 COS 和PNC 對肉仔雞血清IgA 含量的影響 IgA是在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的免疫分子，也是外分泌液中主要的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒和抗毒素作用，而應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致IgA 水平的波動。Huang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，添加COS 可提高肉雞血清中IgA 水平，與本試驗結(jié)果有差異，這可能與添加水平和殼寡糖組分有關(guān)。據(jù)報道，PNC 可提高肉仔雞血清中IgA 水平[6]，與本試驗結(jié)果一致，表明添加PNC 可提高肉仔雞體液免疫水平，這可能與其對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的改善有關(guān)，也可能是PNC 作為抗原通過樹突細胞和巨噬細胞等上調(diào)了機體體液免疫水平。

表9 飼糧中添加COS 和PNC 對肉仔雞盲腸食糜中SCFA 含量的影響 μg/g

3.5 殼寡糖和PNC 對肉仔雞脾臟和回腸mRNA 相對表達量的影響 Takahashi 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后2～4 h，脾臟中炎癥相關(guān)因子IL-1β mRNA 相對表達量先升高后降低，且在刺激后3 h 達到峰值，而脾臟TLR4 的表達量在刺激后4 h 內(nèi)持續(xù)下降，與本試驗結(jié)果一致。IL-1β 是重要的促炎細胞因子，IL-8 是重要的趨化因子，可以募集異噬細胞，用于抗原清除，COS 降低IL-1β 和IL-8 表達可能有利于抑制過度的炎癥反應(yīng)，避免機體損傷。研究證實，COS 抑制LPS 與TLR4/MD-2 受體復(fù)合物結(jié)合，快速磷酸化ERK、JNK和p38，降低MAPK 的活化，減少NF-κB 核易位，最終使LPS 刺激的RAW 264.7 細胞中促炎介質(zhì)（如IL-1β、NO 等）產(chǎn)生減少[9]。Lin 等[19]在研究COS 對血管內(nèi)皮細胞的抗炎作用時得到了相似結(jié)果。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼寡糖降低IL-1β 基因表達，卻未見對NF-κB表達量的顯著影響，其具體機制仍需探究；而LPS 多次刺激降低TLR4 基因表達，這可能是LPS 多次刺激引起了免疫耐受，炎癥反應(yīng)弱化[7]。

3.6 殼寡糖和PNC 對肉仔雞盲腸SCFAs 含量的影響免疫應(yīng)激影響腸道微生物區(qū)系[20]。腸道中SCFA 主要由微生物發(fā)酵未消化的碳水化合物產(chǎn)生，腸道微生物區(qū)系影響SCFA 含量及組成。本研究顯示，LPS 刺激后盲腸丁酸含量顯著降低，可能是由于LPS 刺激擾亂了腸道微生物區(qū)系，使發(fā)酵產(chǎn)生SCFA 的厭氧菌含量下降，從而降低了盲腸SCFA 含量。丁酸可抑制IκB 降解，降低NF-κB 表達，從而抑制IL-1β 產(chǎn)生，這可能是LPS刺激后IL-1β 表達增加的原因之一。COS 顯著提高盲腸食糜中丙酸和丁酸含量，丁酸和丙酸在不同生理濃度共同存在情況下，其生物學(xué)作用十分復(fù)雜，丁酸對基因表達影響最大，丙酸次之[21]。丁酸鹽抑制NF-κB 的核轉(zhuǎn)錄及與DNA 的結(jié)合，或誘導(dǎo)IκB-β 高表達抑制NF-κB表達，抑制NF-κB 信號通路的激活，緩解炎癥反應(yīng)[22]，這可能是COS 抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的途徑之一，但目前缺乏家禽上SCFAs 受體的報道，因此關(guān)于其相互作用機制還有待進一步探究。

4 結(jié) 論

本試驗發(fā)現(xiàn)，添加COS（200 mg/kg）可提高盲腸中SCFA 含量，可改善LPS 刺激肉仔雞的生長性能改變；添加PNC（1×109CFU/kg）可改善機體體液免疫；二者均能緩解LPS 刺激導(dǎo)致的脾臟腫大和IL-1β mRNA 表達增加，緩解機體炎癥反應(yīng)，改善LPS 刺激對肉仔雞的不利影響。