汪 群，閆 鶴

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510641）

腹瀉是仔豬最常發(fā)的疾病之一，由于其高發(fā)病率與高死亡率，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。引發(fā)仔豬腹瀉的病原有多種，其中大腸桿菌，特別是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC），是仔豬腹瀉的重要病原之一[2]。另外，腸道微生物失衡也是導致仔豬腹瀉的一個重要因素[3]。腹瀉發(fā)生時，病原微生物的定植急劇增加，仔豬腸道菌群結構遭到破壞，導致腸道微生態(tài)失衡[4]。分析腹瀉仔豬與健康仔豬的腸道微生物差異，有助于早期診斷和預防腹瀉。

哺乳仔豬腸道環(huán)境和免疫系統(tǒng)還不穩(wěn)定和成熟，對病原微生物特別敏感，因此很容易受到感染而發(fā)生腹瀉。目前對仔豬腸道菌群的研究主要集中在對不同年齡的縱向比較或斷奶前后的飲食變化[5-7]，而對腹瀉與健康仔豬腸道菌群的差異的報道較少。Hermann-Bank 等[3]研究表明，與健康仔豬相比，新生腹瀉仔豬腸道放線菌門和厚壁菌門的相對豐度減少，而腸球菌和大腸桿菌的相對豐度增加。

隨著測序技術的發(fā)展，采用16S rRNA 高通量測序的方法研究腸道菌群已成為熱點。本研究通過對16 頭腹瀉和健康哺乳仔豬的糞便樣本進行16S rRNA 測序，比較腹瀉與健康哺乳仔豬的糞便菌群的結構差異，探究與仔豬腹瀉相關的微生物病原，為腹瀉仔豬的治療提供依據(jù)和預防策略。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從廣東某規(guī)模化養(yǎng)殖場中采集15 日齡健康和腹瀉仔豬糞便樣品各8 份。腹瀉仔豬表現(xiàn)為水樣腹瀉，糞稀，呈灰黃色，利用滅菌醫(yī)用棉簽蘸取肛門處糞便樣品。健康仔豬同樣采用滅菌醫(yī)用棉簽收集2～3 粒糞便樣品。所有樣品經(jīng)干冰運輸至實驗室，-80℃保存。

1.2 樣品總DNA 提取 所有糞便樣品均采用QIAamp stool DNA Mini kit（Qiagen,U.S.）提取樣品總DNA，具體操作嚴格按說明書進行。利用NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。DNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA 基因擴增 選擇16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)作為擴增和測序的目的區(qū)間。引物序列：338F：5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′。反應體系：4 μL 5× FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL Forward Primer（5.0 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5.0 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，10 ng DNA 模板，補足去離子水至20 μL。PCR 儀為ABI GeneAmp?9700 型，擴增程序：95℃預變性3 min，27 個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。

1.4 Illumina Miseq 測 序 使 用AxyPrep DNA 凝 膠 回收試劑盒（Axygen 公司）回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，再用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）檢測定量。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)Illumina MiSeq 平臺（Illumina，USA）進行測序，根據(jù)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300 文庫（上海美吉）。

1.5 統(tǒng)計分析 原始測序序列使用Trimmomatic 和FLASH軟件進行過濾和拼接。使用UPARSE 軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU 聚類。利用UCHIME 軟件剔除嵌合體，采用RDP classifier 貝葉斯算法（置信度閾值為0.7）對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，并在界、門、綱、目、科、屬、種7 個水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成。選擇Silva（Release 123 http://www.arb-silva.de）作為參考基因組數(shù)據(jù)庫。使用Mothur 軟件計算樣本alpha 多樣性指數(shù)，采用Sobs、Ace、Chao、Simpson、Shannon 和Coverage 評估指數(shù)分別對樣本進行alpha 多樣性分析?；贐ray-Curtis 算法計算樣本間距離，并根據(jù)該距離對樣本進行主坐標分析（PCoA）。物種差異分析采用Wilcoxon 秩和檢驗方法，確定2 組糞便菌群中具有顯著性差異的物種。

2 結 果

2.1 測序數(shù)據(jù)整體分析 16 份糞便樣本經(jīng)測序后共得到858 444 條有效序列數(shù)，序列平均長度為454.14 bp，最小樣本序列數(shù)為31 379 bp。對OTU 原始序列按最小樣本序列數(shù)進行抽平，后續(xù)的所有分析均以抽平后的序列為基礎進行聚類分析。通過同源性序列比對及聚類相結合的方法，所有序列共有20 個門、38 個綱、65 個目、121 個科、271 個屬和694 個OTU。

2 組樣本群落覆蓋度超過99%，表明所有樣本的測序深度足夠，可以反映樣本的微生物信息。表1 中Shannon 和Simpson 指數(shù)表明健康組仔豬糞便菌群的多樣性高于腹瀉組（P＜0.05）。Sobs、Ace 和Chao 指數(shù)表明健康組仔豬糞便菌群的豐富度高于腹瀉組，但2 組間差異不顯著。

表1 兩組樣本alpha 多樣性

PCoA 分析用于比較腹瀉和健康仔豬兩組的群落結構。主坐標成分（PC1、PC2 和PC3）占有86.34% 的樣本組成差異，表明健康和腹瀉狀態(tài)下樣本的微生物群落組成是可以相互區(qū)分的，且仔豬腹瀉后糞便菌群結構發(fā)生明顯改變（圖1）。

圖1 Beta 多樣性分析（OTU 水平的糞便菌群PCoA 分析）

2.2 糞便菌群組成結構分析 在門的分類水平上，腹瀉組仔豬糞便菌群的分類數(shù)為16 個，其中變形菌門（Proteobacteria，53.62%）和厚壁菌門（Firmicutes，44.26%）是優(yōu)勢菌，約占總細菌的98%。健康組仔豬糞便中共有13 個菌門，其中厚壁菌門（56.24%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，26.92%）和變形菌門（9.42%）是優(yōu)勢菌（圖2-A）。

在屬的分類水平上，腹瀉組和健康組仔豬糞便菌群的分類數(shù)分別是483 個和453 個，其中2 組共有的菌屬是242 個，占總菌屬的34.87%。腹瀉組仔豬糞便中相對豐度較高的細菌依次是埃希氏- 志賀菌 屬（Escherichia-Shigella，44.49%）、 乳 桿 菌 屬（Lactobacillus，37.32%）、布魯氏菌科未分類的屬（unclassified_Brucellaceae，3.77%）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella，3.59%）（圖2-B）。健康組中相對豐度較高的菌屬則依次為擬桿菌屬（Bacteroides，13.39%）、Lachnoclostridium（9.82%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus，5.66%）、埃希氏-志賀菌屬（5.15%）、梭菌屬（Clostridium，4.51%）和乳桿菌屬（3.73%）等（圖2-B）。

圖2 2 組樣本在門水平（A）和屬水平（B）上的糞便菌群組成結構

2.3 糞便菌群物種差異分析 在門的分類水平上，腹瀉組與健康組之間有明顯差異的菌門有4 種。與健康組比較，腹瀉仔豬糞便中變形菌門的相對豐度顯著增加，擬桿菌門的相對豐度顯著降低（圖3-A）。在屬的分類水平上，在排名前15 的菌屬中，腹瀉組與健康組仔豬之間有明顯差異的菌屬有13 種。相較于健康仔豬，腹瀉組仔豬相對豐度明顯升高的菌屬依次是埃希氏-志賀菌屬、乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬和布魯氏菌科未分類的屬，明顯降低的是擬桿菌屬、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌屬等（圖3-B）。

圖3 2 組樣本在門水平（A）和屬水平（B）上的物種差異分析

3 討 論

動物腸道內(nèi)有大量微生物，相對穩(wěn)定的腸道菌群使腸道具有抵抗病原微生物入侵的作用[8]。本研究采用16S rRNA 高通量測序的方法全面評估哺乳仔豬糞便菌群，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便菌群多樣性低于健康仔豬。Hermann-Bank 等[3]發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬菌群多樣性低于健康仔豬。類似的，Pop 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉兒童的糞便菌群多樣性低于健康兒童。本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便菌群多樣性較健康仔豬顯著減少，推測腹瀉可能是仔豬糞便菌群失衡的重要因素。

本試驗中，健康仔豬糞便菌群中的優(yōu)勢菌主要是厚壁菌門（56.24%）、擬桿菌門（26.92%）和變形菌門（9.42%），與Chen 等[10]研究一致，即厚壁菌門和擬桿菌門是健康哺乳仔豬腸道中豐度最高的菌門。仔豬腹瀉后，其糞便菌群中變形菌門的相對豐度顯著增加，而擬桿菌門顯著減少。變形菌門包括很多病原體，如埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和螺桿菌屬。有研究表明，致病性大腸桿菌是仔豬腹瀉的重要病原菌，其中ETEC 能黏附并產(chǎn)生腸毒素作用于小腸上皮細胞，導致水和電解質(zhì)分泌過多，重吸收減少而導致腹瀉[11]。本研究中，腹瀉仔豬主要是埃希氏-志賀菌屬的相對豐度顯著增加，是健康組仔豬的9 倍，表明埃希氏-志賀菌屬可能是本次仔豬腹瀉發(fā)生的潛在致病菌，為下一步研究與腹瀉相關的菌群及微生物學機制提供一定的基礎。另外，擬桿菌屬、Lachnoclostridium 和瘤胃球菌屬主要參與碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝以及維持腸道正常的生理功能，這些有益菌數(shù)量在腹瀉仔豬糞便中的相對豐度顯著減少，使腸道對碳水化合物的消化吸收和代謝能力減弱，可能與腹瀉發(fā)生相關[12]。

厚壁菌門是所有被檢測仔豬糞便中的優(yōu)勢菌，可產(chǎn)短鏈脂肪酸和調(diào)節(jié)系統(tǒng)免疫反應。乳桿菌屬于厚壁菌門，具有維持腸道正常菌群、抑制病原體粘附小腸壁和防止炎癥發(fā)生等作用，然而具體的作用機制目前還不清楚[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬在腹瀉仔豬中的相對豐度顯著高于健康仔豬（10 倍），主要包括食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus）和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）。食淀粉乳桿菌在仔豬腸道分布很廣泛，能夠通過調(diào)節(jié)細胞因子抑制病原菌粘附小腸壁和保護膜屏障，減輕由ETEC 引起的仔豬腹瀉[14]。約氏乳桿菌參與調(diào)節(jié)細胞因子IL-12 的產(chǎn)生，保護腸黏膜屏障，抑制大腸桿菌的附著[15]。本試驗表明，乳桿菌屬可能在由致病性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉中起到保護作用，然而還需進一步對仔豬的代謝產(chǎn)物等進行研究，探究乳桿菌屬與仔豬腹瀉的相互關系。

Yang 等[16]比較新生腹瀉仔豬與健康仔豬的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道大腸桿菌和乳桿菌屬的相對豐度都減小，與本試驗結果存在一定的差異，可能與仔豬的年齡、遺傳背景以及飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關。

綜上所述，本研究通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)了腹瀉仔豬與健康仔豬糞便菌群的差異，其中某些菌群特異性的增加或減少可作為評價仔豬腹瀉的參考指標，為哺乳仔豬腹瀉的治療及預防提供依據(jù)。