侯勝奎，陶晨雨，胡慧艷，劉 津，李志強，張 婧，賈 青,2,3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，河北保定 071000；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，河北保定 071000）

性別預選在動物生產(chǎn)行業(yè)中起著重要的經(jīng)濟作用，如奶牛行業(yè)更需要母牛，而肉牛行業(yè)則需要公牛[1]。精液中X（雌性）或Y（雄性）精子的分離是一種流行的性別選擇方法。目前已經(jīng)開發(fā)出幾種精子分選技術：基于精子不同免疫學特性進行精子的分選[2-4]，根據(jù)X、Y 精子不同的游泳能力進行精子分選[5]，細胞分離液微分離差異[6]和白蛋白梯度的差異分離等[6-7]精子分選技術。采用流式細胞術分離X、Y 精子被認為是最可靠、有效的方法，可獲得純度大于90%的理想性別精子[8-11]。目前檢測分選精液純度的常用方法為流式細胞儀重分析法和多色熒光原位雜交技術，利用流式細胞儀重分析法檢測時若物種X、Y 精子DNA 含量低于3%，會影響其檢測準確性；多色熒光原位雜交技術復雜，耗時并且需要高技能的技術人員，限制了其應用[12-15]。因此，建立一種快捷、簡便、準確性高的性控精液鑒定方法有重要使用價值及廣闊的應用前景。

PLP 基因又被稱為蛋白質脂蛋白基因，X 染色體特異基因，在胚胎發(fā)育早期的膠質祖細胞中表達，并隨著胚胎發(fā)育成熟而增加[16-20]。Parati 等[21]利用PLP 基因采用探針法對性控精液進行檢測，結果符合預期。SRY 為性別決定基因，被Sinclair 等[22]在哺乳動物性腺中發(fā)現(xiàn)。Koopman 等[23]將含有SRY 基因的DNA 片段（14 kb）移植到XX 染色體的雌鼠體內(nèi)，11 只轉基因XX 小鼠中有3 只成功實現(xiàn)性反轉成為雄性小鼠。本研究對牛X、Y 特有基因PLP、SRY 設計特異引物，構建含有PLP和SRY 基因的質粒，把PLP 和SRY 質粒按照不同比例混合，即X:Y 分別為 1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，進行實時熒光定量PCR，得到標準曲線，建立檢測方法；并對購買的市售性控精液進行實時熒光定量PCR 純度檢測，檢測結果與市售性控精液商標標注純度進行對比，以驗證方法的準確性，為今后開展動物性控精液精確檢測和性別控制進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 中國荷斯坦奶牛血液樣品由徐水縣漕河鎮(zhèn)徐水圣美奶牛專業(yè)合作社提供。中國荷斯坦奶牛性控精液購自內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術有限公司，商業(yè)精液來自3 頭公牛，牛號分別為15516051、15516055、15517034，每頭公牛提供X、Y 性別分選精液和未分選精液各4 支，15516051 號公牛X 分選精液商標純度為90%，Y 分選精液商標純度為92%，未分選精液商標純度為50%；15516055 號公牛X 分選精液商標純度為90%，Y 分選精液商標純度為90%，未分選精液商標純度為50%；15517034 號公牛X 分選精液商標純度為92%，Y 分選精液商標純度為90%，未分選精液商標純度為50%。

1.2 主要試劑 血液、細胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱式）DP304購自天根生化科技（北京）有限公司，F(xiàn)ast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 購 自U S EVRBRIGHT?INC，2×Es Taq MasterMix（Dye）、ddH2O、染料（GelStain）、瓊脂糖（Agarose）、100 bp DNA Ladder，均購自北京全式金生物技術有限公司。特異引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 DNA 提取 牛血液DNA 和精液DNA 提取參考血液、細胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱式）DP304 說明書，將提取的DNA 放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計與合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取牛PLP 基因和SRY 基因，下載基因序列，利用Primer Premier 5.0設計特異引物，引物序列見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 PCR 擴增 PCR 反應體系總體積50 μL：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 37.5 μL。

PLP 基因PCR 反應程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 13 s，32 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。1%凝膠電泳檢測擴增條帶是否為目的條帶。SRY 基因PCR 反應程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 14 s，32 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。1% 凝膠電泳檢測所擴增條帶是否為目的條帶。

1.6 實時熒光定量PCR 反應程序及條件 實時熒光定量PCR 體 系 和 程 序 參 考Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 試劑盒說明書。反應體系：加入qPCR Mix 10 μL、Sense Primer 10 μmol/L 和Anti-sense Primer 10 μmol/L 均0.8 μL，DNA 樣品2 μL，加入ddH2O 補充至20 μL。反應程序：采用三步法，94℃預變性30 s，94℃變性5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，設置40 個循環(huán)。

1.7 質粒提取 取50 μL PCR 產(chǎn)物進行純化，具體操作步驟參考EasyPure PCR Purification Kit 試劑盒說明書。將純化產(chǎn)物-20℃保存。要求PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰，無雜帶，也無引物二聚體。對目的片段連接、轉化，進行質粒提取，提取過程按照SanPrep 柱式質粒小量抽提試劑盒說明書進行操作，質粒需-20℃保存。

1.8 標準品質?？截悢?shù)計算及構建標準曲線 標準品質粒提取后，用NaNoDrop 2000 分光光度計測質粒濃度和質量、A260/280及A260/230，純度在1.8～2.0，可用于構建標準曲線。質?？截悢?shù)計算公式：質粒拷貝數(shù)（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×質粒濃度（ng/μL）/質粒分子量（g/mol）。用稀釋好的濃度為108拷貝至103拷貝的重組質粒作為模板，每個梯度重復3 次，建立標準曲線，先進行預實驗。使用Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 進行實時熒光定量PCR 擴增（反應條件和程序同上）。

1.9 方法的建立 構建2 個含有擴增PLP 基因片段和SRY 序列的質粒，并將其作為性別相關DNA 定量的參考模板，使用不同比例的PLP 和SRY 質粒，即（X:Y分別為1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，終濃度為100 fg 作為已知比率模板用來驗證市售性控精液的方法。

1.10 市售性控精液的檢測 對市售的X、Y 性控精液與未分離精液進行檢測（反應條件和程序同上），使用已知DNA 參考模板構建標準曲線，根據(jù)Ct 值與每種性別特異性DNA 模板拷貝數(shù)之間的關系。使用構建的標準曲線定量市售精液與未分離精液每種性別特異性DNA，每個樣品中X 和Y 含量的總和等于100%，用來估計商業(yè)精液中X 精子含量（X%）和Y 精子含量（Y%）的百分比。

1.11 統(tǒng)計分析 根據(jù)拷貝數(shù)和Ct 值關系計算精液的表達量。表達差異采用SPSS19.0 的單因素方差分析，以P＜0.05 表示顯著差異，以P＞0.05 表示差異不顯著，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 牛PLP 基因和SRY 基因擴增結果 使用母牛DNA樣本對牛X 染色體特異性引物進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測，擴增目標帶大小為214 bp（圖1），與預期片段大小一致。使用公牛和母牛DNA 樣本同時對牛Y 染色體特異性引物進行PCR 擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測，擴增目標帶大小為229 bp（圖2），與預期片段大小一致。

圖1 PLP 基因檢測結果

圖2 SRY 基因檢測結果

2.2 標準曲線結果分析 通過對PLP、SRY 基因標準質粒進行擴增，每個質粒模板3 個重復。標準曲線（圖3 和圖4）顯示，起始模板與Ct 呈良好的線性關系，PLP、SRY 基因質粒模板所建立的直線回歸的決定系數(shù)R2分別達到0.995 9 和0.996 8，表明標準曲線的擬合度極高。

2.3 市售性控精液檢測結果 對市售的X、Y 性控精液與未分離精液進行檢測，使用參考質粒DNA 構建的標準曲線，根據(jù)Ct 值和DNA 模板拷貝數(shù)之間的關系，計算出市售的X、Y 性控精液與未分離精液的純度。如表3 所示，市售精液檢測純度與市售精液商標標注的純度差異不顯著。

圖3 PLP 標準曲線圖

圖4 SRY 標準曲線圖

表3 商業(yè)精液樣品純度檢測

3 討 論

Rath 等[24]采用流式細胞儀對豬分選精液進行二次分離，獲得X 分選精子純度為97%，為了證實X 分選精液的準確性，對體外受精58 h 的胚胎移植到受體母豬輸卵管內(nèi)，并對其后代進行性別跟蹤，結果顯示X分選精液后代母豬比例為97%，未分選精液公豬比例為52%，母豬比例為48%。Brien 等[25]對猩猩、狒狒、獼猴3 種動物精液進行流式細胞儀分離，并對分離后的性控精液采用FISH 評價法和流式細胞儀重分析法再次檢測精液的純度，2 種方法所檢測的X 分選精液、Y 分選精液、未分離精液差異均不顯著。本研究采用實時熒光定量PCR 法對市售牛性控精液純度值進行檢測，被檢測的X 分選精液、Y 分選精液、未分選精液3 種精液純度值與市售精液商標標注純度值差異不顯著；因購買的市售性控精液商標標注純度值是由流式細胞儀重分析法所得，當動物X、Y 精子之間DNA 含量差異大于3%時，流式細胞儀重分析法比較準確[26-27]，牛X、Y 精子DNA 含量差異為3.8%[28]，由此可見流式細胞儀重分析法所檢測的市售性控精液商標標注純度值比較準確，同時，反映出實時熒光定量PCR 法可用于檢測性控精液的純度，經(jīng)實時熒光定量PCR 法對性控精液檢測，檢測結果與市售精液商標標注結果差異不顯著，表明實時熒光定量PCR 可用于動物性控精液純度檢測。

實時熒光定量PCR 相對于流式細胞儀重分析法有一定的優(yōu)勢，如某些動物X、Y 精子DNA 含量差異低于3%，流式細胞儀重分析法檢測結果準確度比較低，目前，流式細胞儀分析法對牛精液分離效果最好[26-27]。而實時熒光定量PCR 檢測方法不會受到X、Y 精子DNA 含量差異的影響，再者，流式細胞儀價格比較昂貴，一般實驗室很難配備，實時熒光定量PCR 檢測方法相對于流式細胞儀分離檢測，適用范圍廣，準確度有保證，成本便宜[28]。采用實時熒光定量PCR 檢測性控精液的純度有一些注意事項：首先，在構建DNA 參考模板時2 種質粒比例一定要充分混勻，如果DNA 參考模板比例混合不均勻將直接影響樣品檢測的結果；再者，使用移液槍移取液體時一定要避免槍頭內(nèi)有殘留液體，否則會影響結果的準確性；采用實時熒光定量PCR 對性控精液純度進行檢測，該檢測法需要特定的儀器，不能直接獲得精液純度，需要間接推測，從而影響了推廣應用。實時熒光定量PCR 檢測方法要求操作者要有嫻熟的操作技巧，并且保證質?；旌暇鶆?，使用精密度比較高的移液槍，從而優(yōu)化實驗結果。雖然實時熒光定量PCR 仍存在不足之處，但這種檢測方法為動物性控精液、性別控制等技術研究發(fā)展奠定了基礎。