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        牛性控精液純度快速評(píng)價(jià)方法研究

        2019-08-12 05:03:42侯勝奎陶晨雨胡慧艷李志強(qiáng)
        中國(guó)畜牧雜志 2019年8期
        關(guān)鍵詞:純度精液精子

        侯勝奎,陶晨雨,胡慧艷,劉 津,李志強(qiáng),張 婧,賈 青,2,3*

        (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071000;2.國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071000;3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071000)

        性別預(yù)選在動(dòng)物生產(chǎn)行業(yè)中起著重要的經(jīng)濟(jì)作用,如奶牛行業(yè)更需要母牛,而肉牛行業(yè)則需要公牛[1]。精液中X(雌性)或Y(雄性)精子的分離是一種流行的性別選擇方法。目前已經(jīng)開發(fā)出幾種精子分選技術(shù):基于精子不同免疫學(xué)特性進(jìn)行精子的分選[2-4],根據(jù)X、Y 精子不同的游泳能力進(jìn)行精子分選[5],細(xì)胞分離液微分離差異[6]和白蛋白梯度的差異分離等[6-7]精子分選技術(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)分離X、Y 精子被認(rèn)為是最可靠、有效的方法,可獲得純度大于90%的理想性別精子[8-11]。目前檢測(cè)分選精液純度的常用方法為流式細(xì)胞儀重分析法和多色熒光原位雜交技術(shù),利用流式細(xì)胞儀重分析法檢測(cè)時(shí)若物種X、Y 精子DNA 含量低于3%,會(huì)影響其檢測(cè)準(zhǔn)確性;多色熒光原位雜交技術(shù)復(fù)雜,耗時(shí)并且需要高技能的技術(shù)人員,限制了其應(yīng)用[12-15]。因此,建立一種快捷、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的性控精液鑒定方法有重要使用價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景。

        PLP 基因又被稱為蛋白質(zhì)脂蛋白基因,X 染色體特異基因,在胚胎發(fā)育早期的膠質(zhì)祖細(xì)胞中表達(dá),并隨著胚胎發(fā)育成熟而增加[16-20]。Parati 等[21]利用PLP 基因采用探針法對(duì)性控精液進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果符合預(yù)期。SRY 為性別決定基因,被Sinclair 等[22]在哺乳動(dòng)物性腺中發(fā)現(xiàn)。Koopman 等[23]將含有SRY 基因的DNA 片段(14 kb)移植到XX 染色體的雌鼠體內(nèi),11 只轉(zhuǎn)基因XX 小鼠中有3 只成功實(shí)現(xiàn)性反轉(zhuǎn)成為雄性小鼠。本研究對(duì)牛X、Y 特有基因PLP、SRY 設(shè)計(jì)特異引物,構(gòu)建含有PLP和SRY 基因的質(zhì)粒,把PLP 和SRY 質(zhì)粒按照不同比例混合,即X:Y 分別為 1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立檢測(cè)方法;并對(duì)購(gòu)買的市售性控精液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 純度檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度進(jìn)行對(duì)比,以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性,為今后開展動(dòng)物性控精液精確檢測(cè)和性別控制進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料 中國(guó)荷斯坦奶牛血液樣品由徐水縣漕河鎮(zhèn)徐水圣美奶牛專業(yè)合作社提供。中國(guó)荷斯坦奶牛性控精液購(gòu)自內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)有限公司,商業(yè)精液來自3 頭公牛,牛號(hào)分別為15516051、15516055、15517034,每頭公牛提供X、Y 性別分選精液和未分選精液各4 支,15516051 號(hào)公牛X 分選精液商標(biāo)純度為90%,Y 分選精液商標(biāo)純度為92%,未分選精液商標(biāo)純度為50%;15516055 號(hào)公牛X 分選精液商標(biāo)純度為90%,Y 分選精液商標(biāo)純度為90%,未分選精液商標(biāo)純度為50%;15517034 號(hào)公牛X 分選精液商標(biāo)純度為92%,Y 分選精液商標(biāo)純度為90%,未分選精液商標(biāo)純度為50%。

        1.2 主要試劑 血液、細(xì)胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(離心柱式)DP304購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,F(xiàn)ast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 購(gòu) 自U S EVRBRIGHT?INC,2×Es Taq MasterMix(Dye)、ddH2O、染料(GelStain)、瓊脂糖(Agarose)、100 bp DNA Ladder,均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。特異引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

        1.3 DNA 提取 牛血液DNA 和精液DNA 提取參考血液、細(xì)胞、組織、基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(離心柱式)DP304 說明書,將提取的DNA 放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取牛PLP 基因和SRY 基因,下載基因序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物,引物序列見表1,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

        表1 引物序列

        1.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系總體積50 μL:10×Buffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,10 μmol/L 上、下游引物各1 μL,Taq 酶0.5 μL,DNA 模板1 μL,ddH2O 37.5 μL。

        PLP 基因PCR 反應(yīng)程序:94℃,5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 13 s,32 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。1%凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶是否為目的條帶。SRY 基因PCR 反應(yīng)程序:94℃,5 min;94℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 14 s,32 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。1% 凝膠電泳檢測(cè)所擴(kuò)增條帶是否為目的條帶。

        1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)程序及條件 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體 系 和 程 序 參 考Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 試劑盒說明書。反應(yīng)體系:加入qPCR Mix 10 μL、Sense Primer 10 μmol/L 和Anti-sense Primer 10 μmol/L 均0.8 μL,DNA 樣品2 μL,加入ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序:采用三步法,94℃預(yù)變性30 s,94℃變性5 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,設(shè)置40 個(gè)循環(huán)。

        1.7 質(zhì)粒提取 取50 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化,具體操作步驟參考EasyPure PCR Purification Kit 試劑盒說明書。將純化產(chǎn)物-20℃保存。要求PCR 產(chǎn)物電泳條帶清晰,無雜帶,也無引物二聚體。對(duì)目的片段連接、轉(zhuǎn)化,進(jìn)行質(zhì)粒提取,提取過程按照SanPrep 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作,質(zhì)粒需-20℃保存。

        1.8 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)??截悢?shù)計(jì)算及構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒提取后,用NaNoDrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒濃度和質(zhì)量、A260/280及A260/230,純度在1.8~2.0,可用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算公式:質(zhì)??截悢?shù)(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(ng/μL)/質(zhì)粒分子量(g/mol)。用稀釋好的濃度為108拷貝至103拷貝的重組質(zhì)粒作為模板,每個(gè)梯度重復(fù)3 次,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。使用Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增(反應(yīng)條件和程序同上)。

        1.9 方法的建立 構(gòu)建2 個(gè)含有擴(kuò)增PLP 基因片段和SRY 序列的質(zhì)粒,并將其作為性別相關(guān)DNA 定量的參考模板,使用不同比例的PLP 和SRY 質(zhì)粒,即(X:Y分別為1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1,終濃度為100 fg 作為已知比率模板用來驗(yàn)證市售性控精液的方法。

        1.10 市售性控精液的檢測(cè) 對(duì)市售的X、Y 性控精液與未分離精液進(jìn)行檢測(cè)(反應(yīng)條件和程序同上),使用已知DNA 參考模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)Ct 值與每種性別特異性DNA 模板拷貝數(shù)之間的關(guān)系。使用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量市售精液與未分離精液每種性別特異性DNA,每個(gè)樣品中X 和Y 含量的總和等于100%,用來估計(jì)商業(yè)精液中X 精子含量(X%)和Y 精子含量(Y%)的百分比。

        1.11 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)拷貝數(shù)和Ct 值關(guān)系計(jì)算精液的表達(dá)量。表達(dá)差異采用SPSS19.0 的單因素方差分析,以P<0.05 表示顯著差異,以P>0.05 表示差異不顯著,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 牛PLP 基因和SRY 基因擴(kuò)增結(jié)果 使用母牛DNA樣本對(duì)牛X 染色體特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增目標(biāo)帶大小為214 bp(圖1),與預(yù)期片段大小一致。使用公牛和母牛DNA 樣本同時(shí)對(duì)牛Y 染色體特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增目標(biāo)帶大小為229 bp(圖2),與預(yù)期片段大小一致。

        圖1 PLP 基因檢測(cè)結(jié)果

        圖2 SRY 基因檢測(cè)結(jié)果

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分析 通過對(duì)PLP、SRY 基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)質(zhì)粒模板3 個(gè)重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3 和圖4)顯示,起始模板與Ct 呈良好的線性關(guān)系,PLP、SRY 基因質(zhì)粒模板所建立的直線回歸的決定系數(shù)R2分別達(dá)到0.995 9 和0.996 8,表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度極高。

        2.3 市售性控精液檢測(cè)結(jié)果 對(duì)市售的X、Y 性控精液與未分離精液進(jìn)行檢測(cè),使用參考質(zhì)粒DNA 構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)Ct 值和DNA 模板拷貝數(shù)之間的關(guān)系,計(jì)算出市售的X、Y 性控精液與未分離精液的純度。如表3 所示,市售精液檢測(cè)純度與市售精液商標(biāo)標(biāo)注的純度差異不顯著。

        圖3 PLP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        圖4 SRY 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        表3 商業(yè)精液樣品純度檢測(cè)

        3 討 論

        Rath 等[24]采用流式細(xì)胞儀對(duì)豬分選精液進(jìn)行二次分離,獲得X 分選精子純度為97%,為了證實(shí)X 分選精液的準(zhǔn)確性,對(duì)體外受精58 h 的胚胎移植到受體母豬輸卵管內(nèi),并對(duì)其后代進(jìn)行性別跟蹤,結(jié)果顯示X分選精液后代母豬比例為97%,未分選精液公豬比例為52%,母豬比例為48%。Brien 等[25]對(duì)猩猩、狒狒、獼猴3 種動(dòng)物精液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分離,并對(duì)分離后的性控精液采用FISH 評(píng)價(jià)法和流式細(xì)胞儀重分析法再次檢測(cè)精液的純度,2 種方法所檢測(cè)的X 分選精液、Y 分選精液、未分離精液差異均不顯著。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)市售牛性控精液純度值進(jìn)行檢測(cè),被檢測(cè)的X 分選精液、Y 分選精液、未分選精液3 種精液純度值與市售精液商標(biāo)標(biāo)注純度值差異不顯著;因購(gòu)買的市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度值是由流式細(xì)胞儀重分析法所得,當(dāng)動(dòng)物X、Y 精子之間DNA 含量差異大于3%時(shí),流式細(xì)胞儀重分析法比較準(zhǔn)確[26-27],牛X、Y 精子DNA 含量差異為3.8%[28],由此可見流式細(xì)胞儀重分析法所檢測(cè)的市售性控精液商標(biāo)標(biāo)注純度值比較準(zhǔn)確,同時(shí),反映出實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法可用于檢測(cè)性控精液的純度,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)性控精液檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與市售精液商標(biāo)標(biāo)注結(jié)果差異不顯著,表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可用于動(dòng)物性控精液純度檢測(cè)。

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相對(duì)于流式細(xì)胞儀重分析法有一定的優(yōu)勢(shì),如某些動(dòng)物X、Y 精子DNA 含量差異低于3%,流式細(xì)胞儀重分析法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度比較低,目前,流式細(xì)胞儀分析法對(duì)牛精液分離效果最好[26-27]。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法不會(huì)受到X、Y 精子DNA 含量差異的影響,再者,流式細(xì)胞儀價(jià)格比較昂貴,一般實(shí)驗(yàn)室很難配備,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法相對(duì)于流式細(xì)胞儀分離檢測(cè),適用范圍廣,準(zhǔn)確度有保證,成本便宜[28]。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)性控精液的純度有一些注意事項(xiàng):首先,在構(gòu)建DNA 參考模板時(shí)2 種質(zhì)粒比例一定要充分混勻,如果DNA 參考模板比例混合不均勻?qū)⒅苯佑绊憳悠窓z測(cè)的結(jié)果;再者,使用移液槍移取液體時(shí)一定要避免槍頭內(nèi)有殘留液體,否則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)性控精液純度進(jìn)行檢測(cè),該檢測(cè)法需要特定的儀器,不能直接獲得精液純度,需要間接推測(cè),從而影響了推廣應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法要求操作者要有嫻熟的操作技巧,并且保證質(zhì)?;旌暇鶆颍褂镁芏缺容^高的移液槍,從而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR 仍存在不足之處,但這種檢測(cè)方法為動(dòng)物性控精液、性別控制等技術(shù)研究發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

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