邵 凡，李紅偉，段金琳，李俊英，吳常信*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007）

性激素是維持動物性功能和第二性征的物質(zhì)，同時(shí)在參與機(jī)體蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)代謝中起到重要作用。在雌性動物體內(nèi)，卵巢在垂體釋放的促性腺激素調(diào)控下，合成和分泌以雌二醇為主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。除了卵巢外，腎上腺是雌性動物合成雄激素的另一個(gè)主要器官。摘除雌性動物的卵巢，即去勢后，紊亂的性激素水平負(fù)反饋調(diào)節(jié)垂體，改變垂體分泌激素的水平，或直接作用于其他靶器官，共同引起機(jī)體表型變化。

雌激素應(yīng)答基因GREB1 是雌激素受體調(diào)控通路中的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子[1]，在參與哺乳動物乳腺癌的形成和細(xì)胞分化過程中起到重要作用[2]。有關(guān)GREB1 基因在調(diào)控動物其他發(fā)育過程中的作用鮮有報(bào)道，僅Li 等[3]研究發(fā)現(xiàn)GREB1 與斑馬魚的垂體發(fā)育有關(guān)。基于此，本研究選擇白來航母雞為實(shí)驗(yàn)材料，以去勢母雞雄性化為表型，研究去勢對母雞垂體和腎上腺發(fā)育的影響，并將GREB1 作為垂體發(fā)育候選基因，檢測去勢母雞垂體GREB1 mRNA 水平相對表達(dá)量，旨在為進(jìn)一步研究性腺對下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 本研究中采用的白來航母雞來自于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽遺傳資源與育種試驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)組為 6 只于 9 周齡摘除卵巢的白來航母雞，對照組為 6只未摘除卵巢的同日齡母雞。飼養(yǎng)至97 周齡時(shí)屠宰，測量冠高、距長、腎上腺重和垂體重，并將垂體組織保存于液氮中。

1.2 血清雌二醇和睪酮濃度測定 上午靜脈采血。采血前限飼12 h，每只雞采 2 份血樣，放置于4℃分離血清，測量血清中性激素濃度，并計(jì)算 2 份樣品的平均值作為最終激素濃度。血清激素濃度測定由北京華英生物技術(shù)研究所采用 γ-911 全自動放免計(jì)數(shù)儀、E2-17β（HY-10029）放免試劑盒以及睪酮（HY-10027）放免試劑盒完成。

1.3 垂體總RNA 提取及定量引物 試劑盒提取垂體總RNA。將垂體組織放入1 mL TRIzol 中勻漿裂解，離心取上清，加入200 μL 氯仿混勻，室溫放置3 min。離心取上清，加入300 μL 無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱 CR3 中，之后的步驟同動物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP431）。

利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)GREB1 定量引物，引物序列F：5'- ACAAGACCATCGGTGTTAGGC-3'，R：5'-GGTGACCAACCTTTATGGCGT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用Prism7 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、作圖。2 組間差異采用 t-test 分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié) 果

2.1 去勢對母雞血清雌二醇和睪酮濃度的影響 由表1 可知，去勢母雞血清雌二醇濃度低于未去勢母雞（P＜0.01），血清睪酮濃度與未去勢組無顯著差異。

表1 去勢對母雞血清激素濃度的影響

2.2 去勢對母雞冠高、距長及腎上腺、垂體重量的影響表2 顯示，去勢母雞的冠高（P＜0.01）、距長（P＜0.01）和垂體重（P＜0.05）高于未去勢母雞，去勢母雞的腎上腺重低于未去勢母雞（P＜0.01）。

表2 去勢對母雞第二性征及垂體、腎上腺重的影響

2.3 垂體GREB1 mRNA 相對表達(dá)量 圖1 顯示，去勢母雞垂體GREB1 相對表達(dá)量低于未去勢母雞（P＜0.05）。

圖1 去勢對母雞垂體GREB1 mRNA 相對表達(dá)量

3 討 論

雌性動物的卵巢除了產(chǎn)生卵細(xì)胞外，還可分泌以雌二醇為主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。本實(shí)驗(yàn)中，白來航母雞摘除卵巢后，血清雌二醇濃度顯著降低，與Terada 等[4]對白來航母雞去勢的研究結(jié)果一致。Valdez等[5]摘除2 個(gè)近交系母雞的卵巢并測定54 周齡時(shí)血清性激素水平的研究顯示，卵巢摘除后，血清性激素水平的變化在2 個(gè)近交系中有相同趨勢，均為去勢母雞雌激素濃度顯著降低，雄激素濃度升高，但未達(dá)到顯著水平，與本實(shí)驗(yàn)中白來航去勢母雞的血清雌二醇、睪酮濃度變化趨勢一致。卵巢摘除后，母雞血清雌激素濃度減少，雄激素濃度增加，使母雞向雄性化發(fā)育。在雌性動物體內(nèi)，除了卵巢外，腎上腺貢獻(xiàn)了機(jī)體30%～50%的雄激素[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去勢可降低母雞腎上腺重，這一結(jié)果與Kitay[7]對雌性大鼠去勢的結(jié)果一致。

垂體是機(jī)體“首要”的內(nèi)分泌腺，在垂體分泌的促性腺激素刺激下，性腺分泌性激素，而摘除家禽的卵巢導(dǎo)致血清性激素水平紊亂，又可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)垂體的激素分泌，引起垂體功能改變[4]。研究發(fā)現(xiàn)，摘除大鼠睪丸可引起垂體肥大和機(jī)能亢進(jìn)[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，摘除母雞卵巢可顯著增加垂體重，與Kitay[7]對雌性大鼠去勢的結(jié)果一致。垂體有垂體前葉、垂體中葉和垂體后葉3個(gè)區(qū)域，垂體前葉包括遠(yuǎn)側(cè)部和少量結(jié)節(jié)部，約占垂體重量的80%，在垂體分泌功能中起到主要作用。雌激素被認(rèn)為可以使垂體前葉細(xì)胞快速凋亡[9]，這也是本實(shí)驗(yàn)中母雞去勢后垂體重量增加的原因。

SIX 同源蛋白家族、WNT/β-catenin 和Notch 信號通路以及SOX 轉(zhuǎn)錄因子等在垂體形成和功能維持過程中可能起到調(diào)控作用[10]。近年，Li 等[3]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體調(diào)控通路中一個(gè)早期的應(yīng)答基因GREB1 參與斑馬魚的垂體發(fā)育，GREB1 被發(fā)現(xiàn)與多種細(xì)胞分化能力有關(guān)，其表達(dá)量受到雌激素正向調(diào)控[11-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去勢母雞垂體GREB1 mRNA 水平表達(dá)量顯著低于正常母雞，且垂體GREB1 表達(dá)量與垂體重量呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié) 論

在去勢母雞雄性化過程中，垂體和腎上腺發(fā)揮了重要作用。母雞去勢后，血清雌二醇濃度和腎上腺重量降低，垂體重量增加，與垂體發(fā)育相關(guān)的基因GREB1 表達(dá)量下降，這一結(jié)果為研究雌激素受體介導(dǎo)的垂體發(fā)育提供參考。腺體重量的改變將會引起腺體功能改變，去勢后垂體、腎上腺中基因表達(dá)的變化還需進(jìn)一步研究。