李卓航，寸博文，文禹粱，趙生國，蔡 原

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

藏豬（Sus scrofa）等青藏高原土著動(dòng)物形成了一種可以研究人類與動(dòng)物適應(yīng)低氧的“群體優(yōu)勢(shì)”[1]，最終表現(xiàn)在動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)特征和基因差異表達(dá)等方面[2-3]。對(duì)甘孜、迪慶、合作及西藏藏豬促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因的研究表明，EPO 具有獨(dú)特的單核苷酸及氨基酸變異[4]；在基因組水平上篩選出了藏豬更多低氧適應(yīng)相關(guān)基因和SNPs（單核苷酸多態(tài)性）[5]。有研究表明，脯氨酰羥化酶蛋白（EGLN1）基因與藏族人血液中血紅蛋白濃度關(guān)系密切[2]，但針對(duì)豬的低氧適應(yīng)相關(guān)研究較少。EGLN1 基因又被稱為PHD2，是一個(gè)關(guān)鍵的氧傳感基因[6]，也是最早發(fā)現(xiàn)與低氧有關(guān)的基因。近年來研究表明，脯氨酸羥化酶（PHD）是脯氨酸羥化酶家族的一個(gè)成員，其在缺氧誘導(dǎo)因子的羥基化調(diào)解中起著重要作用，被認(rèn)為是細(xì)胞的“氧感受器”[7-8]。本文對(duì)藏豬EGLN1 基因exon 4 及部分核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序分析，以期為探索和揭示藏豬低氧適應(yīng)的分子學(xué)機(jī)制提供參考，也對(duì)挖掘藏豬優(yōu)良種質(zhì)資源、維系青藏高原生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有理論意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究分別從不同海拔地區(qū)采集了4 個(gè)藏豬群體（西藏藏豬、合作藏豬、甘孜藏豬和迪慶藏豬）、八眉豬、煙臺(tái)黑豬及2 個(gè)引入種豬（長白豬和大白豬）共35 頭豬的組織樣品（表1）。

表1 樣品信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用常規(guī)酚- 氯仿抽提法提取基因組DNA。根據(jù)杜洛克豬EGLN1 基因全序列（登錄號(hào)NW_001885473）設(shè)計(jì)引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 擴(kuò)增采用50 μL 體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、56.5℃退火30 s、72℃延伸30 s、共30 次循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0% 瓊脂糖凝膠、150 V 電壓下電泳檢測(cè)20 min，將條帶清晰明亮目的產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 引物信息

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用Chromas Version 2.33 對(duì)原始序列進(jìn)行編輯，利用MEGA5.0 及ClustalX 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，運(yùn)用PopGen32 軟件計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率。

2 結(jié) 果

2.1 EGLN1 基因exon 4 等位基因檢測(cè) EGLN1 基因exon 4 核苷酸序列變異位點(diǎn)分析采用Chromas Version 2.33 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，獲得全長為333 bp 核苷酸序列，位于已發(fā)表的杜洛克豬EGLN1 基因全序列（NW_001885473） 的48 090～48 422 bp 處。 采 用MEGA7.0 軟件對(duì)西藏藏豬、合作藏豬、甘孜藏豬、迪慶藏豬、八眉豬、長白豬、大白豬、煙臺(tái)黑豬8 個(gè)群體共35 條核苷酸序列分析表明，EGLN1 基因exon 4 核苷酸序列在266 bp 處發(fā)生了C→T 的顛換，4 個(gè)藏豬群體和八眉豬在第266 堿基處均為C，而3 個(gè)選育豬種（長白豬、大白豬和煙臺(tái)黑）在該處存在C/T 雜合及TT 純合現(xiàn)象（圖1）。

圖1 EGLN1 基因exon 4 PCR 測(cè)序電泳圖

2.2 EGLN1 基因exon 4 基因型分析 根據(jù)EGLN1 基因exon 4 上266 bp 處發(fā)生的顛換，界定出CC、CT 和TT 3 種基因型。對(duì)8 個(gè)豬群體的基因型分析發(fā)現(xiàn)（表3），高原豬種4 個(gè)藏豬群體和八眉豬群體只存在CC 基因型，而3 個(gè)選育豬種（長白豬、大白豬、煙臺(tái)黑豬）共15個(gè)個(gè)體存在3 種基因型，其中CC 型有5 個(gè)、CT 型有6 個(gè)、TT 型有4 個(gè)。基因型頻率分析表明，CC 基因型在藏豬和八眉豬中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，頻率均為1，而3 個(gè)選育豬種中3 種基因型都存在，頻率介于0.20～0.60。就基因頻率而言，藏豬和八眉豬只有等位基因C，而等位基因T 在選育豬種中的頻率有0.40。

表3 EGLN1 基因exon 4 基因型頻率和基因頻率

3 討 論

近年來研究表明，EGLN1 基因在高海拔低氧環(huán)境適應(yīng)的人群中存在很強(qiáng)的正選擇，它是歐亞人群(包括藏族)和安第斯人群共同的與高海拔低氧環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因[9-11]。EGLN1 受選擇的范圍很寬廣，其基因多態(tài)性與血紅蛋白含量較低相關(guān)，而較低的血紅蛋白含量正是藏族適應(yīng)低氧環(huán)境的生理反應(yīng)的原因之一[12]。本研究對(duì)4 個(gè)藏豬群體（西藏藏豬、甘孜藏豬、迪慶藏豬、合作藏豬）、八眉豬和選育的大白豬、長白豬、煙臺(tái)黑豬EGLN1 基因分析發(fā)現(xiàn)，在第4 外顯子的266 bp 處發(fā)生了堿基C→T 的顛換，4 個(gè)藏豬群體和八眉豬在第266 bp 處均為C，而長白豬和大白豬及煙臺(tái)黑豬群體在該處存在C/T 雜合現(xiàn)象。說明分布在海拔較高（2 300 m以上）的地方豬種藏豬和八眉豬與海拔較低的煙臺(tái)黑豬、長白豬和大白豬在EGLN1 基因上有著截然不同的遺傳變異。

本研究在EGLN1 基因發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)界定的2 個(gè)等位基因（C 和T）及3 個(gè)基因型（CC、CT、TT）分布具有明顯的海拔特征。在較高海拔的八眉豬和高海拔藏豬群體中只存在1 種等位基因C 和基因型CC。關(guān)于人的EGLN1 基因多態(tài)性研究也表明藏漢人群之間存在顯著差異，這一結(jié)果為研究人類和動(dòng)物在極端環(huán)境下的適應(yīng)性進(jìn)化提供參考[13]。在對(duì)藏族人群高原低氧適應(yīng)性遺傳機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，EGLN1 基因有2 個(gè)SNP 位點(diǎn)，且因此界定的基因型和頻率與漢族人差異極顯著，并認(rèn)為這種變異位點(diǎn)及頻率之間差異的顯著性與藏族人適應(yīng)高原低氧環(huán)境存在相關(guān)性[14]。對(duì)藏綿羊和湖羊EGLN1基因多態(tài)性研究也表明，藏綿羊具有優(yōu)勢(shì)基因型和等位基因，且與湖羊基因頻率差異顯著，推測(cè)藏綿羊的優(yōu)勢(shì)基因型可能更有利于高原低氧適應(yīng)[15]。而本研究中低海拔的大白豬、長白豬、煙臺(tái)黑豬群與高海拔豬種之間等位基因、基因型頻率及組成的特征性差異，推測(cè)可能與藏豬長期適應(yīng)性進(jìn)化中的環(huán)境選擇有關(guān)。