吳 雨，宋汝謀，陳 偉，楊忠誠(chéng)，盧賢君，黃明捷，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.安順市畜牧技術(shù)推廣站，貴州安順 561000；4.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州貴陽(yáng) 550025）

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育受許多因素影響，而這些因素都直接或間接受促生長(zhǎng)激素軸的調(diào)控[1]。動(dòng)物的促生長(zhǎng)激素軸主要包括生長(zhǎng)激素釋放因子、生長(zhǎng)激素和胰島素生長(zhǎng)因子[2]，其中生長(zhǎng)激素（Growth Hormone，GH）是促生長(zhǎng)激素軸的核心組成部分，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起決定作用。GH 是一種單鏈多肽激素，由垂體前葉分泌，是一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類激素[3-5]。Vasilatos-younken 等[6]研究表明，GH 與其受體結(jié)合后能刺激局部組織產(chǎn)生胰島素生長(zhǎng)因子來調(diào)節(jié)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。進(jìn)一步研究表明，GH 基因多態(tài)位點(diǎn)能夠顯著影響牛的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能。谷朝勇[7]研究發(fā)現(xiàn)，魯西黃牛GH 基因2 639 bp處存在堿基C→G 突變，相關(guān)分析得到等位基因B 是影響牛體尺性狀的優(yōu)勢(shì)基因。張超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)西門塔爾牛GH 基因的突變BB 基因型屠宰性能指標(biāo)顯著高于其他基因型，表明BB 基因型對(duì)西門塔爾牛生長(zhǎng)發(fā)育有利。張艷麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，早勝牛GH 基因第2、5 外顯子突變的BB 和CD 基因型對(duì)其生長(zhǎng)階段的體重影響均顯著高于其他基因型。綜上，GH 基因在其他地方品種牛上已有相關(guān)研究并取得了一些成果，但其在貴州地方黃牛上未見相關(guān)報(bào)道。關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛屬于貴州優(yōu)良地方品種，其中的關(guān)嶺牛早在1982 年就被錄入《中國(guó)畜禽品種志》，是“中國(guó)五大名?！敝籟10]。關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛均含有人體必需的8 種氨基酸，其肉制品蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量較低，深受人們喜愛[11]。但以上品種牛存在體格偏小、生長(zhǎng)速度緩慢等問題，在一定程度上影響其發(fā)展[12]。故本實(shí)驗(yàn)以威寧牛、黎平牛、思南牛、關(guān)嶺牛為研究對(duì)象，以影響生長(zhǎng)性狀的GH 基因?yàn)楹蜻x基因，篩選多態(tài)位點(diǎn)，為后期探究GH 基因?qū)F州地方黃牛生長(zhǎng)性狀的影響機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 牛血樣分別采自貴州省關(guān)嶺縣、思南縣、威寧縣、黎平縣，其中關(guān)嶺牛82 頭、思南和威寧各50 頭、黎平32 頭（共214 頭，年齡均為2 歲）。頸靜脈采血，存于抗凝管中，置-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 DM2000 DNAMarker、核酸染料、2Es Taq Master Mix（鼎國(guó)生物工程技術(shù)有限公司）；血液基因組提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；雙蒸水、TAE 緩沖液（實(shí)驗(yàn)室自備）。

1.3 血液基因組DNA 提取 采用血液基因組提取試劑盒對(duì)樣品基因組DNA 進(jìn)行抽提，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及OD 值，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其完整性。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 采用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中牛GH基因的參考序列（GenBank 登錄號(hào)：NC_037346），用Premier 5.0 對(duì)牛GH 基因第1、2、3、4、5 外顯子設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。PCR 體系為20 μL：2×Es Taq Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL（10 pmol/μL），ddH2O 5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸30 s，72℃終延伸5 min，35 個(gè)循環(huán)。

表 1 引物序列

1.5 篩選多態(tài)性位點(diǎn) 采用DNA 混池方法將214 頭牛種血樣DNA 每份取1 μL 進(jìn)行混合，混合后的總DNA取1 μL 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行單向測(cè)序，應(yīng)用DNAStar 軟件中SeqMan Ⅱ程序?qū)y(cè)序峰圖進(jìn)行分析比對(duì)，并與NCBI 上發(fā)布的序列進(jìn)行對(duì)比分析，篩選貴州地方黃牛SNPs 位點(diǎn)。

1.6 等位基因頻率估算 應(yīng)用MWSnap 軟件測(cè)量各SNPs 位點(diǎn)等位基因峰高。并應(yīng)用公式fi= hi/（h1+h2）（i=1，2）來估算等位基因頻率。其中，fi 為SNP 位點(diǎn)某等位基因的頻率；h1、h2 分別表示測(cè)序圖上等位基因1、2 的峰高。

1.7 生物信息學(xué)分析 訪問ExPASy 服務(wù)器（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）分析牛GH 蛋白理化性質(zhì)，訪問ExPASy 服 務(wù) 器（http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）提交GH 蛋白的氨基酸序列，對(duì)其親水性和疏水性進(jìn)行分析，用TMHMM 軟件（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)牛GH 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，用SignalP 軟件預(yù)測(cè)牛GH 蛋白信號(hào)肽，用SOPMA 軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)牛GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血液基因DNA 濃度和純度，用含核酸染料的1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶明亮無明顯拖尾（圖1），可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 4 個(gè)牛種血液基因組DNA 提取檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR 擴(kuò)增 如圖2 所示，GH 基因第1、2、3、4、5 外顯子經(jīng)PCR 擴(kuò)增后分別獲得364、359、382、421、531 bp 的目的片段，每個(gè)目的片段無雜帶，特異性較好，可用作下一步測(cè)序。

2.3 測(cè)序 從4 個(gè)牛種（關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛）中共檢測(cè)出2個(gè)SNPs 位點(diǎn)（Exon5-G1570C、Exon5-A1720C），均位于第5 外顯子。再分別混合每一品種牛的總DNA 取1 μL 為模板，對(duì)第5 外顯子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并分別測(cè)序。如圖3 所示，關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛中均存在這2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，而黎平牛僅存在1 個(gè)SNPs 位點(diǎn)（Exon5-A1720C）。

2.4 等位基因頻率估算 從表2 可見，Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均發(fā)生在基因編碼區(qū)，其中Exon5-G1570C 為錯(cuò)義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼崆以撐稽c(diǎn)基因頻率在3 個(gè)牛種（關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛）中差別較大，威寧牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種；Exon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未改變且4 個(gè)牛種中均發(fā)現(xiàn)該突變，其中黎平牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種。

2.5 生物信息學(xué)分析

圖2 GH 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖3 GH 基因PCR 產(chǎn)物測(cè)序峰圖及SNP 位點(diǎn)

表2 牛GH 基因SNPs 等位基因頻率估算

2.5.1 GH 基因突變前后的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) GH基因突變前后的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖4），編碼區(qū)突變位點(diǎn)Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均導(dǎo)致mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Exon5-G1570C 位點(diǎn)：自由能由-109.33 J/mol 變?yōu)?106.48 J/mol，突變后，RNA 自由能升高，穩(wěn)定性降低。Exon5-A1720C 位點(diǎn)：自由能由-109.33J/mol 變?yōu)?110.62 J/mol，突變后，RNA 自由能降低，穩(wěn)定性升高。

圖4 GH 基因G5170C、A1719C 位點(diǎn)突變前后mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

2.5.2 GH 蛋白理化性質(zhì)分析 如表3 所示，牛GH 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為27 385.45，理論等電點(diǎn)為6.90，其中Ala、Gln、Gly、Leu、Ser、Thr 氨基酸個(gè)數(shù)均超過15，且Leu 所占比列最高，為13.10%；而Asn、Cys、His、Ile、Met、Trp、Tyr 氨基酸個(gè)數(shù)均低于10，其中Trp 所占比列最少，為0.80%。

表3 牛GH 蛋白氨基酸含量及所占比例

2.5.3 疏水性分析 由圖5 可知，在第25～70、130～160位這2 個(gè)區(qū)域的氨基酸疏水值頻率較密集集中，其中第48 位氨基酸疏水值最大（3.133）；在第60～128、162～243 位這2 個(gè)區(qū)域的氨基酸親水值頻率較密集集中，其中第123 位氨基酸親水值最小（-2.767）。綜上可知，整個(gè)多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

圖5 牛GH 蛋白疏水性分析

2.5.4 跨膜區(qū) 如圖6 顯示，牛GH 蛋白所包含的區(qū)域不僅在膜內(nèi)且跨過膜外，故牛GH 蛋白是跨膜蛋白。

圖6 牛GH 蛋白跨膜區(qū)域分析

2.5.5 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 如圖7 所示，表明牛GH 蛋白有信號(hào)肽序列，序列為MAAGPRTSLLLAFALLCLPWTQVVGA，推測(cè)GH 蛋白可能在跨膜運(yùn)輸起著信號(hào)識(shí)別作用，剪切位點(diǎn)位于第53 和第54 位氨基酸之間。

圖7 牛GH 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.5.6 二級(jí)結(jié)構(gòu) 運(yùn)用SOPMA 在線軟件預(yù)測(cè)GH 基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果可知，GH 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由4 個(gè)結(jié)構(gòu)組成，分別是α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角及擴(kuò)展鏈。其中，α-螺旋占53.06%，無規(guī)則卷曲占42.04%，擴(kuò)展鏈占2.45%，β-轉(zhuǎn)角占2.45%；其中α-螺旋所占比例分別是無規(guī)則卷曲、擴(kuò)展鏈、β-轉(zhuǎn)角的1.3、21.7、21.7 倍；α- 螺旋結(jié)構(gòu)主要集中在第35～44、60～88、120～140、144～152、155～181、206～220、223～234 位 置區(qū)域；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)集中在第2～26、45～51、54～59、89～94、100～119、182～189、192～205、 237～244 區(qū)域；擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)集中在第96～99 位置區(qū)域；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)集中在52～53、96～99 位置區(qū)域。

3 討 論

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育受多種激素調(diào)節(jié)，而GH 能夠調(diào)節(jié)機(jī)體中大部分的脂肪、蛋白質(zhì)和核酸的代謝[13]。GH主要通過2 種途徑發(fā)揮作用，一是誘導(dǎo)肝臟、肌肉等組織的細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)激素介質(zhì)發(fā)揮作用；二是直接作用于靶組織細(xì)胞發(fā)揮生理功能[14]。近年來，GH 基因已成為提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、生長(zhǎng)速度等方面的研究熱點(diǎn)之一。郝靈慧[15]研究發(fā)現(xiàn)，草原紅牛GH 基因3′UTR 突變位點(diǎn)與其屠宰性狀指標(biāo)呈顯著相關(guān)，且突變位點(diǎn)分型基因BB 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。李軍[16]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛GH 基因第5 外顯子2 141 bp 處存在C→G 突變，等位基因G 對(duì)生長(zhǎng)性能具有正效應(yīng)。牛志剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，GH 基因第5 外顯子的GH/Alu Ⅰ突變位點(diǎn)分型基因L 等位基因?qū)π陆峙Ｔ缙谏L(zhǎng)發(fā)育性狀有正向選擇作用。胡怡菲等[18]則在秦川牛GH 基因第5 外顯子發(fā)現(xiàn)2 處SNPs，其中組合ABCD 型各體尺性狀數(shù)值均高于AB 和CD 基因型，提示組合ABCD 基因型是影響秦川牛體尺性狀的最佳基因型組合。高雪等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛GH 基因第5 外顯子突變位點(diǎn)且該位點(diǎn)突變分型基因B 等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。目前，關(guān)于貴州地方黃牛GH 基因多態(tài)性的研究未見報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛和黎平牛的GH 基因進(jìn)行SNP 位點(diǎn)檢測(cè)，首次在4 個(gè)牛種中發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNPs，即Exon5-G1570C、Exon5-A1720C，這與上述研究結(jié)果相符[17-19]，均在第5 外顯子發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，說明牛GH 基因在第5外顯子具有高度多態(tài)性，但與前人所發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)不一致，表明不同地方的牛種具有其地方品種特點(diǎn)。

本研究中，2 個(gè)SNPs 均發(fā)生在編碼區(qū)，其中Exon5-G1570C 為錯(cuò)義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?，Exon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未發(fā)生改變。而編碼區(qū)核苷酸的改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而影響其功能[20]，故推測(cè)Exon5-G1570C 突變較Exon5-A1720C 突變會(huì)更大程度上改變牛GH 蛋白生理學(xué)功能。同時(shí)，黎平牛中僅存在Exon5-A1720C 位點(diǎn)，其余3 個(gè)品種均存在2 個(gè)突變位點(diǎn)，可能是相同環(huán)境條件下，經(jīng)過長(zhǎng)期人工選育、優(yōu)勝劣汰使品種間差異不大或樣本量不夠所致，具體原因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。通過等位基因頻率估算，在Exon5-G1570C 位點(diǎn)處，編碼的氨基酸發(fā)生改變且該位點(diǎn)基因頻率在3 個(gè)牛種（關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛）中差別較大，威寧牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種；而Exon5-A1720C 位點(diǎn)處，編碼的氨基酸并未改變且4 個(gè)牛種中均發(fā)現(xiàn)該突變，其中黎平牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種。由此發(fā)現(xiàn)，這2 個(gè)SNPs 可能與貴州地方黃牛遺傳差異有關(guān)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)均位于第5 外顯子，而外顯子的突變可能會(huì)引起mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，故對(duì)4 個(gè)牛品種GH 基因進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 位點(diǎn)突變均會(huì)導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。具體表現(xiàn)：當(dāng)Exon5-G1570C 位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，Exon5-A1720C 位點(diǎn)為A 或C 時(shí)，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，穩(wěn)定性減小，自由能增大；當(dāng)外顯子Exon5-A1720C 位點(diǎn)發(fā)生突變，Exon5-G1570C位點(diǎn)為G 或C 時(shí)，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增大，自由能減小。這說明突變位置不同，對(duì)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)不同。綜上，根據(jù)本研究結(jié)果及結(jié)合前人在其他牛種上的研究成果推斷GH 基因可為貴州地方牛種生長(zhǎng)性狀等標(biāo)記輔助選擇提供相應(yīng)的分子標(biāo)記。

4 小 結(jié)

本研究以貴州4 個(gè)地方牛種（關(guān)嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用混池DNA 結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)貴州地方黃牛GH 基因多態(tài)性，共篩選出2 個(gè)SNPs，且突變前后GH 基因mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，Exon5-G1570C 位點(diǎn)mRNA 自由能升高，穩(wěn)定性降低；Exon5-A1720C 位點(diǎn)則自由能降低，穩(wěn)定性升高，這表明突變位置不同，對(duì)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)不同。其中Exon5-G1570C 為錯(cuò)義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼幔珽xon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未發(fā)生改變，推測(cè)Exon5-G1570C 突變較Exon5-A1720C 突變會(huì)更大程度上改變牛GH 蛋白的生理學(xué)功能。進(jìn)一步結(jié)合前人在其他牛種上的研究成果推斷GH 基因可為貴州地方黃牛生長(zhǎng)性狀等標(biāo)記輔助選擇提供相應(yīng)的分子標(biāo)記，篩選出的多態(tài)位點(diǎn)可為貴州地方黃牛生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記提供參考。