吳海豐 李 琪 Juliy M Perelman Victor P Kolosov Andrei Shpakou 周向東

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,?？?70102)

慢性氣道炎性疾病常伴有氣道阻塞，氣道機(jī)械作用力亦有改變，其中剪應(yīng)力的改變尤為突出，異常升高的應(yīng)力可誘導(dǎo)氣道黏液高分泌[1]。過(guò)量的黏稠液體不但影響氣道上皮纖毛的正常擺動(dòng)、削弱氣道廓清能力、降低氣道防御功能，還有助于病原微生物的寄殖，使呼吸道炎癥趨于惡化。皮層肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽(Cortactin)是大多數(shù)極化上皮細(xì)胞皮層區(qū)域中的一種肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白[2]，其在氣道黏液出胞分泌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，但目前Cortactin參與該過(guò)程的確切機(jī)制尚未明了。故本實(shí)驗(yàn)以剪應(yīng)力作為刺激因素，分別轉(zhuǎn)染Cortactin定點(diǎn)突變體，比較剪應(yīng)力作用后各組細(xì)胞中不同位點(diǎn)p-Cortactin蛋白水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC含量的差別，推斷出Cortactin介導(dǎo)MUC5AC分泌的關(guān)鍵位點(diǎn)，為慢性氣道炎性疾病的治療提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 氣道上皮細(xì)胞Beas-2B(美國(guó)ATCC)；10%小牛血清、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)；各型Cortactin突變體及野生型Cortactin重組真核表達(dá)載體(重醫(yī)劉春漪博士饋贈(zèng))；MUC5AC單克隆抗體(Chemico公司)；鼠抗人 Cortactin及p-Cortactin單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、引物(上海生科公司)；剪應(yīng)力裝置(重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 將Beas-2B細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育，當(dāng)細(xì)胞融合約達(dá)80%時(shí)，用PBS沖洗2遍，并予細(xì)胞分組：空白對(duì)照組：僅予等體積的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，未予其他特殊處理。SS組：僅予剪應(yīng)力刺激，30 r/min，30 min。SS+野生型Cortactin組：轉(zhuǎn)染野生型Cortactin后予剪應(yīng)力刺激30 min。SS+pcDNA3-Cortactin421-MU組：轉(zhuǎn)染pcDNA3-Cortactin421-MU后予剪應(yīng)力刺激細(xì)胞30 min。SS+pcDNA3-Cortactin466-MU組：轉(zhuǎn)染pcDNA3-Cortactin466-MU后予剪應(yīng)力刺激細(xì)胞30 min。SS+pcDNA3-Cortactin482-MU組：轉(zhuǎn)染pcDNA3-Cortactin482-MU后予剪應(yīng)力刺激細(xì)胞30 min。將上述各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵育箱繼續(xù)孵育，24 h 后取細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將Beas-2B細(xì)胞密度調(diào)整至5×105/孔并接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)將各型表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按LipofeetamineTM2000說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染后PBS液洗滌3次，加入含有10%FBS+DMEM的培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，每5 h換液1次，24 h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染鑒定。

1.2.3 剪應(yīng)力處理 旋轉(zhuǎn)裝置的周期性變速過(guò)程等效于氣道氣體流動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪應(yīng)力(SS)。該裝置在周期性變速旋轉(zhuǎn)過(guò)程中，細(xì)胞與表面液體將產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，即可產(chǎn)生剪應(yīng)力。為模擬氣道上皮細(xì)胞黏液高分泌的病理狀態(tài)，我們將剪應(yīng)力的大小設(shè)置在4～6 dynes/cm2之間，即旋轉(zhuǎn)參數(shù)為30 r/min，30 min。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Cortactin、p-Cortactin水平 收集各組細(xì)胞，PBS液洗滌，加入細(xì)胞裂解液裂解后離心，12 000 r/min，4℃，20 min，取上清液經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉2 h，分別加入鼠抗人Cortactin 單克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗p-Cortactin單克隆抗體(1∶1 000)；室溫孵育2 h，分別加入山羊抗小鼠 IgG-HRP，室溫孵育2 h。TBST液洗膜后于ECL溶液顯色5 min，結(jié)果與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶相比較，兩者的比值作為Cortactin、p-Cortactin的相對(duì)含量。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞MUC5AC mRNA表達(dá)水平 Trizol 法分別提取各組細(xì)胞總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測(cè)定RNA在260 nm和280 nm的A 值，樣品A260/A280均介于1.8～2.0。兩步法行RT-PCR。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。MUC5AC引物：上游5′-TCCGGCCTCATCTTCTCC-3′,下游5′-ACTTGGGCACTGGTGCTG-3′;GAPDH引物序列：上游5′-TAATCATGATATGGGAGAGTAGT-3′,下游5′-TGTATATGTCACTCCACATATAC-3′。PCR完成后，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果經(jīng)吸光度面積積分分析，以與GAPDH mRNA(管家基因)的比值作為相對(duì)值。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的MUC5AC蛋白相對(duì)含量 吸取各組樣品50 μl，包被于96孔酶標(biāo)板，4℃下過(guò)夜，晾干，PBS液漂洗3次，2%BSA室溫封閉1 h。PBS再次洗板3次，加入1∶200的小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體45 μl，用PBS(含 0.05%Tween-20)稀釋至50 μl，室溫孵育1 h。PBS液再次洗板3次，加入45 μl用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶500)，室溫孵育1 h。棄二抗，PBS液再次洗板3次，加入四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶顯色，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定各孔樣品吸光度值(A450 nm)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，所得比值即為各組MUC5AC蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 Cortactin轉(zhuǎn)染Beas-2B細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 各組細(xì)胞內(nèi)Cortactin蛋白的相對(duì)表達(dá)量用Western blot法檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的Cortactin蛋白相對(duì)含量明顯低于轉(zhuǎn)染野生型Cortactin組、pcDNA3-Cortactin421-MU組、SS+pcDNA3-Cortactin466-MU組、SS+pcDNA3-Cortactin482-MU組(P值均<0.01)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功(表1、圖1)。

n=6)

GroupsCortactinControl0.444±0.031Wild-Cortactin0.729±0.0411)pcDNA3-Cortactin421-MU0.731±0.0361)pcDNA3-Cortactin466-MU0.718±0.0251)pcDNA3-Cortactin482-MU0.745±0.0291)

Note：1)P<0.01 compared with control group.

圖1 各組細(xì)胞Cortactin的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative level of Cortactin in each groupNote: 1.Control group;2.Wild-Cortactin group;3.pcDNA3-Cortactin421-MU group;4.pcDNA3-Cortactin466-MU group;5.pcDNA3-Cortactin482-MU group.

圖2 各組細(xì)胞p-Cortactin的表達(dá)水平Fig.2 Relative level of p-Cortactin in each groupNote: 1.Control group;2.SS+wild-Cortactin group;3.SS+pcDNA3-Cortactin421-MU group;4.SS;5.SS+pcDNA3-Cortactin466-MU group;6.SS+pcDNA3-Cortactin482-MU group.

2.2 各組細(xì)胞p-Cortactin水平表達(dá)情況 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞p-Cortactin水平，單純剪應(yīng)力(SS)刺激下，p-Cortactin表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明氣道剪應(yīng)力可促進(jìn)Cortactin蛋白磷酸化；與單純SS刺激組相比，轉(zhuǎn)染野生型Cortactin后，再予SS刺激，p-Cortactin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與SS+野生型Cortactin組相比，SS+pcDNA3-Cortactin-MU組的p-Cortactin蛋白水平顯著下降(P<0.01)，而SS+pcDNA3-Cortactin421-MU組和SS+pcDNA3-Cortactin482-MU組的p-Cortactin蛋白水平則無(wú)明顯變化(P>0.05)，表明當(dāng)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)Y466突變后，Cortactin磷酸化功能將隨之降低(圖2，表2)。

Groupsp-Cortactin MUC5ACmRNA MUC5ACproteinControl group0.125±0.0070.302±0.041 0.218±0.037SS group0.333±0.0191)0.749±0.1641) 0.611±0.0401)SS+Wild-Cortactin group0.527±0.0102)0.714±0.125 0.692±0.0463)SS+pcDNA3-Cortactin421-MU group0.528±0.0160.727±0.043 0.706±0.053SS+pcDNA3-Cortactin466-MU group0.122±0.0084)0 .735±0.122 0.201±0.0244)SS+pcDNA3-Cortactin482-MU group0.532±0.0100.742±0.118 0.689±0.048

Note：Compared with control group，1)P<0.01；compared with SS group，2)P<0.01；compared with SS group，3)P<0.05；compared with SS+ wild-Cortactin group 4)P<0.01.

2.3 轉(zhuǎn)染Cortactin對(duì)細(xì)胞MUC5AC表達(dá)及分泌的影響 經(jīng)RT-PCR法和ELISA法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，SS組的細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白的相對(duì)含量顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明了剪應(yīng)力(SS)能誘Beas-2B細(xì)胞MUC5AC的過(guò)量表達(dá)和分泌。與單純SS刺激組相比，SS+野生型Cortactin組的MUC5AC蛋白相對(duì)含量明顯升高(P<0.05)，但MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，說(shuō)明Cortactin可促進(jìn)MUC5AC的胞外分泌，但對(duì)MUC5AC基因的表達(dá)無(wú)明顯影響。與SS+野生型Cortactin組相比，SS+pcDNA3-Cortactin421-MU組、SS+pcDNA3-Cortactin482-MU組細(xì)胞培養(yǎng)上清液的MUC5AC蛋白相對(duì)含量變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而SS+pcDNA3-Cortactin466-MU組的MUC5AC蛋白顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但各轉(zhuǎn)染組間的MUC5AC mRNA水平明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

病原微生物的繁殖和炎癥細(xì)胞的趨化是慢性氣道炎性疾病的關(guān)鍵因素，而淤積的痰液則是病原體寄殖的良好培養(yǎng)基。過(guò)多的氣道黏液不但無(wú)物理屏障作用，還會(huì)減弱氣道上皮的清除功能，誘發(fā)炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥因子的釋放，而某些炎癥因子又可誘導(dǎo)黏液的合成與分泌，加重原有的氣道炎癥[4]。慢性氣道炎性疾病急性發(fā)病時(shí)黏液的產(chǎn)生常導(dǎo)致氣道阻塞，加之原有的氣道重構(gòu)，故呼吸時(shí)氣道所受機(jī)械作用力明顯上升，其中以剪應(yīng)力的改變尤為顯著，是刺激氣道黏液分泌常見(jiàn)的維持性因素。另外，臨床中使用機(jī)械通氣時(shí)，氣道上皮受到明顯的應(yīng)力作用，過(guò)強(qiáng)的通氣壓力將誘發(fā)氣道黏液分泌，蓄積的黏液增加氣道阻塞，形成惡性循環(huán)。

Cortactin作為酪氨酸蛋白激酶Src的作用底物而首次被發(fā)現(xiàn)，多研究表明，Cortactin是細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架組裝和去組裝過(guò)程中的重要調(diào)控者，在細(xì)胞偽足的形成、細(xì)胞遷移、膜流動(dòng)性、胞吞等過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色[5-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Cortactin還參與氣道黏液分泌[3]。Cortactin作為介導(dǎo)性因子，一方面介導(dǎo)MARCKS和F-actin的連接，將黏蛋白的分泌顆粒向質(zhì)膜的方向極向遷移；另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的組裝，增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性及黏蛋白的出胞位點(diǎn)，促進(jìn)MUC5AC囊泡的胞外分泌。本研究以剪應(yīng)力為刺激因素，成功構(gòu)建氣道黏液高分泌模型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Cortactin可在剪應(yīng)力的作用下發(fā)生磷酸化，p-Cortactin可促進(jìn)氣道MUC5AC分泌，而對(duì)MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄基本無(wú)影響。

Cortactin參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吐及胞吞等活動(dòng)與其磷酸化狀態(tài)密切相關(guān)。Cortactin主要有4個(gè)功能區(qū)域，分別為N末端酸性結(jié)構(gòu)域(NTA)、串聯(lián)重復(fù)區(qū)域、C-端富含脯氨酸區(qū)域及SH3區(qū)域。其中C-端含有3個(gè)Src磷酸化位點(diǎn)—Y421、Y466、Y482[8-10]。研究表明，Cortactin磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變后，其對(duì)細(xì)胞骨架重塑的調(diào)控作用也隨之喪失[11]。雖前期研究已闡明p-Cortactin能促進(jìn)氣道黏蛋白的出胞運(yùn)動(dòng)，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Cortactin介導(dǎo)黏蛋白分泌的關(guān)鍵作用位點(diǎn)尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)染定點(diǎn)突變體 Cortactin466-MU后再予剪應(yīng)力處理，細(xì)胞p-Cortactin及細(xì)胞培養(yǎng)上清液MUC5AC水平顯著降低，但細(xì)胞MUC5ACmRNA含量無(wú)明顯變化。故我們推斷，在剪應(yīng)力刺激誘導(dǎo)的MUC5AC高分泌過(guò)程中，Cortactin具有重要的調(diào)控功能，并且其酪氨酸磷酸化位點(diǎn)Y466為其介導(dǎo)該過(guò)程中的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。即當(dāng)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)Y466發(fā)生磷酸化后，可誘導(dǎo)F-actin的聚合和收縮運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)黏蛋白的分泌出胞。

本研究證實(shí)了Cortactin在參與剪應(yīng)力誘導(dǎo)的氣道MUC5AC分泌過(guò)程中的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。啟示抑制Cortactin的表達(dá)或功能可降低應(yīng)力誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌，有利于氣道物理屏障功能的維持，減輕氣道炎癥，為慢性氣道炎性疾病的治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)，同時(shí)還為臨床中機(jī)械通氣壓力參數(shù)的選擇提供了理論基礎(chǔ)。