袁廣勝 吳海東 陳勝利 李小梅 邵 楠 王紀(jì)斌 張 婷

(東營勝利醫(yī)院，東營257055)

血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)與其他類型的細(xì)胞如血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞等相比較，保留高度的可塑性[1]。在正常狀態(tài)下，VSMCs具有收縮和舒張血管、維持血壓平衡、調(diào)節(jié)血管張力和血流量等功能。當(dāng)細(xì)胞周圍環(huán)境發(fā)生改變時，VSMCs發(fā)生可逆轉(zhuǎn)的表型轉(zhuǎn)化，由生理狀態(tài)下的收縮表型(分化表型)轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?去分化表型)，由此獲得增殖、遷移及合成分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)和促炎因子的能力[2]。VSMCs表型轉(zhuǎn)化是細(xì)胞自我修復(fù)的機制，同時也成為新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄的重要病理基礎(chǔ)。最新文獻(xiàn)報道顯示VSMCs和VSMCs表型轉(zhuǎn)化在顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysms，IAs)的形成、進(jìn)展和破裂中發(fā)揮重要作用[1,3,4]。IAs的形成是血流動力學(xué)因素以及一系列復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)所引起的腦血管瘤樣突起，人群平均患病率1%～5%，高風(fēng)險人群為19%[5]。IAs破裂是引起自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的首位原因，致殘率和致死率高達(dá) 25%～50%，嚴(yán)重威脅人類生命和健康[6]。目前，IAs臨床治療主要包括手術(shù)治療和血管介入治療，尚未發(fā)現(xiàn)有效的藥物。因此，深入闡述IA的分子生物學(xué)機制對于提供有效的藥物靶點至關(guān)重要。本研究以體外培養(yǎng)的VSMCs為研究對象，揭示流體切應(yīng)力對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響及相關(guān)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM低糖培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM、胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司產(chǎn)品)，實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，兔抗大鼠LC3、Beclin-1多克隆抗體(Sigma 公司)，兔抗大鼠β-actin 單克隆抗體(艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司)，兔抗大鼠α-SMA、SM-22a、SM-MHC多克隆抗體，兔抗大鼠MMP-2和TNF-α多克隆抗體(美國 Santa 公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒SABC、DAB顯色試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs培養(yǎng)及鑒定 大鼠腦VSMCs購自A.T.C.C.(Manassas,VA,U.S.A.)。VSMCs用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，實驗用第3～5代細(xì)胞。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和α-SMA的免疫細(xì)胞化學(xué)染色對VSMCs進(jìn)行鑒定。

1.2.2 流體切應(yīng)力沖擊VSMCs 將傳至3～5代的VSMCs接種到載玻片上，待細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%后轉(zhuǎn)移到流室的測試區(qū)，密封后進(jìn)行流體剪切實驗。提供的流室內(nèi)剪切力為15.28 dyne/cm2，細(xì)胞經(jīng)15.28 dyne/cm2流體剪切力分別處理6、12、24 h。蠕動泵為實驗系統(tǒng)提供穩(wěn)定的定常流，用無血清DMEM 培養(yǎng)基作為灌流液體。對照組VSMCs靜止培養(yǎng)，不經(jīng)剪切力處理。SS+3-MA組與SS+Rapa組分別于流體剪切力沖擊VSMCs前6 h給予3-MA或 Rapa預(yù)處理。

1.2.3 Real-time PCR 分別收集各組各時間點細(xì)胞，按照總RNA抽提取試劑盒說明書提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄及定量PCR反應(yīng)均按試劑說明書操作。引物序列如下:α-SMA引物序列:上游5′-AGTCGCCATCAGGAACCTCGAG-3′，下游5′-ATCTTTTCGATGTCGTCCCAGTTG-3′；SM-22a引物序列:上游5′-GCATAAGAGGGAGTTCACAGACA-3′，下游5′-GCCTTCCCTTTCTAACTGATGATC-3′；MMP-2引物序列:上游5′-CCAGCCAGTCCGATTTGA-3′，下游5′-CTGATAACCTGGATGCAGTCGT-3′；TNF-α引物序列:上游5′-AAAGCATGATCCGAGATGT-3′，下游5′-AGCAGGAATGAGAAGAGGC-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列:上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATCTCACGCACGATTTC-3′。 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃擴(kuò)增變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，使用2-ΔΔCt法計算 mRNA 表達(dá)量。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將接種于置有滅菌蓋玻片的24孔板，每孔約1×105個，細(xì)胞融合至50%～70%時用甲醛固定，加入3%雙氧水浸泡，5% BSA封閉液30 min，甩干后滴加兔抗大鼠的α-SMA 和LC-3多克隆抗體(稀釋度均為1∶100)，4℃孵育過夜。次日用PBS漂洗3次，5 min/次，滴加羊抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，37℃孵育30 min，SABC液孵育40 min，DAB顯色3～5 min。終止反應(yīng)后蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.5 Western blot法 收集各組細(xì)胞，按常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，以12 000 r/min離心15 min后留取上清。BCA法測定上清液蛋白濃度，蛋白變性后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以干轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)時間為50 min。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠多克隆抗體(稀釋度1∶500)，4℃孵育過夜。次日以TBST洗膜5次，5 min/次，滴加羊抗兔的二抗(稀釋度1∶5 000)，室溫孵育2 h，以TBST洗膜5次，5 min/次，ECL顯色液進(jìn)行曝光。Image J醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的鑒定結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)可見貼壁細(xì)胞以梭形為主，也呈現(xiàn)不規(guī)則形或星形，有多個細(xì)胞突起，胞漿豐富，細(xì)胞核卵圓形位于中央，某些區(qū)域重疊生長，表現(xiàn)為典型的“谷峰狀”生長(圖1A)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色:制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞融和達(dá)到 50%～70% 時，使用特異性抗體α-SMA 鑒定VSMCs，光鏡下可見胞漿呈現(xiàn)深棕黃色，證實細(xì)胞α-SMA相關(guān)抗原表達(dá)呈現(xiàn)陽性(圖1B)，鑒定細(xì)胞為VSMCs。

2.2 流體切應(yīng)力誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化 與對照組比較，SS組VSMCs的收縮表型標(biāo)志基因α-SMA(P6 h=0.026 2,P12 h=0.014 1,P24 h=0.004 0)，SM-22a(P6 h=0.031 8,P12 h=0.016 5,P24 h=0.008 2)mRNA水平明顯下調(diào)，而合成表型標(biāo)志基因MMP-2(P6 h=0.010 4,P12 h=0.004 9,P24 h=0.000 3)和TNF-α(P6 h=0.022 1,P12 h=0.007 4,P24 h=0.000 8)的mRNA水平明顯上調(diào)，從6 h到24 h下調(diào)/上調(diào)基因的改變均呈現(xiàn)顯著的時間依賴性。這些結(jié)果表明流體切應(yīng)力可促進(jìn)VSMCs由收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化(圖2)。

2.3 流體切應(yīng)力促進(jìn)VSMCs的自噬激活 據(jù)報道自噬在血管重塑中扮演重要角色，參與多種血管疾病的病理過程。為了明確流體切應(yīng)力是否可激活VSMCs自噬，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的蛋白定位情況，結(jié)果顯示:流體切應(yīng)力暴露后24 h，VSMCs胞漿呈現(xiàn)深棕褐色，免疫反應(yīng)強陽性，揭示流體切應(yīng)力可激活VSMCs自噬(圖3)。為進(jìn)一步驗證這一結(jié)論，采用免疫印跡的方法檢測不同時間點VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:SS組與正常組相比VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05,圖4)。

圖1 VSMCs的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of VSMCsNote: Morphological feature of VSMCs under inverted phase contrast microscope(A) and the locational expression of α-SMA in VSMCs(B),Bar=20 μm.

圖2 VSMCs收縮表型與合成表型標(biāo)志基因的表達(dá)Fig.2 Expressions of VSMCs contractile and synthetic marker genesNote: Real-time PCR results showed that SS could induced phenotypic modulation of VSMCs.*.P<0.05 vs control group.

2.4 自噬可調(diào)控SS誘導(dǎo)的VSMCs的表型轉(zhuǎn)化 如上的結(jié)果已經(jīng)證實流體切應(yīng)力可誘導(dǎo)VSMCs自噬的激活，但激活的自噬在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的調(diào)控作用尚不明確。本研究在流體切應(yīng)力沖擊前6 h 用自噬激動劑(Rapa)或抑制劑(3-MA)預(yù)孵育細(xì)胞，探討自噬水平的高低對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響。與SS組相比，自噬激動劑組VSMCs中α-SMA 和SM-22a蛋白表達(dá)顯著升高，而MMP-2和TNF-α的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，表明自噬水平上調(diào)能夠促進(jìn)流體切應(yīng)力誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化。與之相反，自噬水平下調(diào)可以顯著抑制流體切應(yīng)力誘導(dǎo)的α-SMA和SM-22a的下調(diào)，以及MMP-2和TNF-α表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)，揭示自噬水平下調(diào)可以抑制流體切應(yīng)力誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化?？傊@些結(jié)果表明流體切應(yīng)力通過激活自噬調(diào)控VSMCs的表型轉(zhuǎn)化(圖5)。

圖3 自噬標(biāo)記分子在VSMCs中的蛋白定量表達(dá)Fig.3 Location of autophagy marker protein LC3 inVSMCsNote: Immunocytochemical staining indicated that SS could effectively induced the expression of LC3 in the cells,Bar=20 μm.

圖4 VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)變化Fig.4 Expression of autophagy protein LC3 and Beclin-1 in VSMCsNote: Representative photographs and Histograms of Western blot.*.P<0.05 vs control group.

圖5 Rapa 和 3-MA 預(yù)處理對 α-SMA、SM-22a、MMP-2和TNF-α蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Rapa or 3-MA on α-SMA，SM-22a，MMP-2 and TNF-α expressionsNote: Representative photographs and Histograms of Western blot.*.P<0.05 vs control group; #.P<0.05 vs SS group.

3 討論

VSMCs不是終末分化細(xì)胞，其可以調(diào)節(jié)自身表型以適應(yīng)周圍環(huán)境因素的改變。文獻(xiàn)已報道VSMCs由分化狀態(tài)(收縮表型)向去分化狀態(tài)(合成表型)的轉(zhuǎn)化在多種增生性心血管疾病中扮演重要角色，包括動脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等[7]。近年來越來越多的研究表明VSMCs表型轉(zhuǎn)化也參與了IAs的形成、發(fā)展及破裂[3,4]。在IAs形成早期，VSMCs遷移到內(nèi)膜中，增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)成分。Nakajima等[8]應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法在IAs的瘤壁中清晰顯示VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，即瘤壁VSMCs的收縮表型標(biāo)志蛋白表達(dá)減少，合成表型蛋白表達(dá)增多，然而在破裂動脈瘤中兩種表型均消失。VSMCs由收縮表型到合成表型的轉(zhuǎn)化，其增殖和合成新細(xì)胞外基質(zhì)，最終可增強不斷退化的IAs瘤壁的抗拉強度。因此，調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化在IAs瘤壁的退化和最終破裂中至關(guān)重要。本研究采用流體切應(yīng)力誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型，模擬IAs發(fā)生發(fā)展中VSMCs的病理改變，揭示VSMCs表型轉(zhuǎn)化的上游分子調(diào)控機制，為IAs的早期診斷及藥物治療提供新的靶點。

血流切應(yīng)力是引發(fā)IAs發(fā)生及其發(fā)展的首要因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)Willis環(huán)大動脈局部的高切應(yīng)力參與了顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制[9]。并且流體切應(yīng)力可以調(diào)節(jié)VSMCs的增殖、遷移、分化及內(nèi)皮細(xì)胞的功能[10]。因此本研究第一部分以大鼠動脈VSMCs為研究對象，觀察不同時間流體切應(yīng)力沖擊VSMCs能否誘導(dǎo)體外培養(yǎng)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。Real-time PCR和免疫印跡結(jié)果顯示流體切應(yīng)力作為一種應(yīng)激刺激因素，可降低VSMCs的收縮表型(分化表型)標(biāo)志基因的表達(dá)水平，然而可上調(diào)合成表型(去分化表型)標(biāo)志基因的表達(dá)量。這些結(jié)果表明流體切應(yīng)力可誘導(dǎo)大鼠的VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，并且具有一定的時間依賴性。然而，流體切應(yīng)力對大鼠VSMCs表型的調(diào)控是否與自噬相關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(Autophagy related gene,ATG)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子的過程，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[11]。先前的研究報道顯示誘發(fā)血管疾病的刺激物和應(yīng)激源可以激活自噬過程，進(jìn)而導(dǎo)致VSMCs表型和功能發(fā)生改變[12]。其次多數(shù)生長因子被證實為VSMCs表型轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子，其部分通過調(diào)節(jié)自噬活性實現(xiàn)[13]。本研究在VSMCs暴露切應(yīng)力刺激后的不同時間點檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)，其各時間點LC3和Beclin-1表達(dá)的上調(diào)證實流體切應(yīng)力可激活VSMCs自噬。盡管多數(shù)研究已證明VSMCs自噬在再狹窄、動脈粥樣硬化和高血壓血管壁中被激活，但是自噬在血管健康和疾病中作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)流體切應(yīng)力沖擊可增強體外培養(yǎng)大鼠VSMCs的自噬水平，進(jìn)一步應(yīng)用自噬抑制劑3-MA與Rapa探討自噬在流體切應(yīng)力誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用。結(jié)果顯示自噬抑制劑可以部分逆轉(zhuǎn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，與之相反，自噬激動劑可以進(jìn)一步促進(jìn)切應(yīng)力刺激下VSMCs表型轉(zhuǎn)化。據(jù)報道血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)可快速誘導(dǎo)VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，值得注意的是PDGF-BB可增強VSMCs自噬水平，激活自噬可清除收縮蛋白與被脂質(zhì)親電試劑損傷的蛋白[14,15]。依據(jù)本實驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)我們推斷流體切應(yīng)力可通過激活自噬誘導(dǎo)大鼠VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本研究通過系列實驗證實流體切應(yīng)力可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠VSMCs表型轉(zhuǎn)化，深入探討其相關(guān)分子調(diào)控機制發(fā)現(xiàn)流體切應(yīng)力通過激活自噬調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化。本研究深化了對IAs形成、發(fā)展及破裂機制的理解，為IAs的早期診斷及藥物治療提供可能的分子靶點。目前對流體切應(yīng)力激活自噬過程中所涉及的分子信號通路尚不清楚，這將是本課題組下一步的研究目標(biāo)。