冒 靈 胡 琳 劉士明 褚風(fēng)云 賈 力 陳 超 徐 林

(遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室暨貴州省基因檢測與治療特色重點實驗室，遵義563000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是以肺部急性炎癥為特征的一種嚴重的炎癥疾病，是敗血癥、出血性休克、嚴重創(chuàng)傷等危重疾病的并發(fā)癥[1-3]。盡管多種治療策略如干細胞治療、細胞因子治療和激素類治療被應(yīng)用于ALI的臨床研究中，但近年來ALI的發(fā)生率和死亡率仍居高不下[4-6]。這些治療策略在臨床上應(yīng)用效果受限的一個主要原因就是我們對ALI發(fā)生的分子病理機制仍未明確了解。近年來研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶4(Mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4)作為非典型MAPK家族分子的成員之一，參與機體多種生理、病理過程，如免疫應(yīng)答、腫瘤生成[7-9]。然而，MAPK4是否參與肺部疾病(如ALI)的病理發(fā)生進程還未有文獻報道。因此，本研究擬利用MAPK4-/-小鼠，建立LPS(脂多糖)誘導(dǎo)的小鼠ALI模型，觀察MAPK4敲除對小鼠ALI病理損傷的可能影響，并探討其可能機制，為后續(xù)臨床治療新策略的提出提供重要的前期實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 7～10周C57BL/6背景的SPF級WT和MAPK4-/-小鼠；LPS(Sigma)；顯微鏡(Olympus)；C1000 Thermal cycler熒光定量PCR儀、S1000 Thermal cycler PCR儀、Western blot電泳儀、Bio-Rad ChemiDocTMMP imaging System(Bio-Rad)；RNAiso Plus、Prime Script RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ(×2)(TaKaRa)；4%多聚甲醛、三氯甲烷、異丙醇(重慶川東化工公司)；PCR引物(生工生物工程有限公司)，見表1；兔抗鼠AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH一抗(Cell Signaling Technol-ogy)，兔抗鼠MAPK4一抗(Abcam)；HRP標記的羊抗兔IgG二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)；全蛋白提取試劑盒(凱基生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、抗體稀釋液(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 對小鼠進行生存分析 按照15 mg/kg LPS的劑量對小鼠進行腹腔注射，觀察并記錄兩組小鼠生存情況。

1.2.2 建立小鼠ALI模型 按照10 mg/kg LPS的劑量對小鼠進行腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠ALI模型。24 h 后，記錄兩組小鼠體重變化,觀察肺臟炎性情況，劑量參考文獻[10]。

1.2.3 HE染色觀察肺臟組織的病理學(xué)變化 取WT和MAPK4-/-小鼠的肺臟組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，然后用石蠟包埋，制成5 μm切片并進行HE(蘇木精-伊紅)染色， 最后在倒置顯微鏡下觀察肺臟組織的病理學(xué)變化。

表1 Real-time PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences of real-time PCR

NameSequences(5'-3')Length(bp)IL-1βSenseTGCCACCTTTTGACAGTGATG220AntisenseAAGGTCCACGGGAAAGACACTNF-αSenseCAGGGGCCACCACGCTCTTC121AntisenseTTTGTGAGTGTGAGGGTCTGGTGF-βSenseGGCGGTGCTCGCTTTGTA201AntisenseTCCCGAATGTCTGACGTATTGAGAPDHSenseGAGCCAAACGGGTCATCATCT232AntisenseGAGGGGCCATCCACAGTCTT

1.2.4 Real-time PCR 檢測肺臟組織中炎性因子的mRNA表達水平 分別提取ALI模型下的WT和MAPK4-/-小鼠的肺臟組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行Real-time PCR檢測。Real-time PCR檢測體系為20 μl，其中SRBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物混合液1 μl，高壓的三蒸水7 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 20 s，72℃ 10 s，重復(fù)40個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)置3個復(fù)孔，復(fù)孔間Cq值差異不超過0.5者用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 Western blot檢測肺臟組織中相關(guān)信號通路分子的蛋白表達水平 稱取約0.025 g的ALI模型下的WT和MAPK4-/-小鼠肺臟組織，加入300 μl含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的Lysis裂解液,組織破碎儀70 Hz破碎10 s。4℃裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，取上清用于BCA法測蛋白濃度，加入5× loading buffer，98℃變性10 min。經(jīng)10%SDS-PAGE分離，250 mA濕轉(zhuǎn)60 min后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育 1 h，利用Bio-Rad ChemiDocTMMP imaging System檢測分析蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 ALI模型下小鼠的生存情況 生存分析結(jié)果顯示，LPS 腹腔注射后，與WT小鼠相比，MAPK4-/-小鼠的生存時間明顯延長(圖1，P<0.05)。

圖1 15 mg/kg LPS 腹腔注射后，WT和MAPK4-/-小鼠的生存情況(n=6)Fig.1 Survival curve of WT mice and MAPK4-/- mice treated with i.p.15 mg/kg LPS(n=6)Note:*.P<0.05.

2.2 ALI模型下小鼠的體重指數(shù)和肺臟臟器指數(shù)變化 如圖2所示，與WT小鼠相比，MAPK4-/-小鼠的肺臟充血明顯減少(圖2A)。然而兩組小鼠體重指數(shù)和肺臟臟器指數(shù)均未發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖2B、C，P>0.05)。

2.3 ALI模型下小鼠肺臟組織的病理學(xué)變化 HE結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MAPK4-/-小鼠的肺泡間質(zhì)增厚明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少(圖3)。

2.4 觀察ALI模型下小鼠肺臟組織中炎性因子的mRNA表達水平 Real-time PCR結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MAPK4-/-小鼠的促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平明顯降低，而抑炎因子TGF-β的mRNA表達水平明顯增高(圖4，P<0.05)。

圖2 10 mg/kg LPS腹腔注射后的WT和MAPK4-/-小鼠的體重變化和肺臟臟器指數(shù)變化(n=6)

Fig.2 Change of weight and lung weight index in WT mice and MAPK4-/-mice treated with i.p.10 mg/kg LPS (n=6)

Note: A.The picture of lung in WT or MAPK4-/-mice;B.The change of lung weight in WT or MAPK4-/-mice;C.The change of lung weight in WT or MAPK4-/-mice.NS.No significant change.

圖3 10 mg/kg LPS腹腔注射后的WT和MAPK4-/-小鼠的肺臟組織病理學(xué)變化(HE染色)Fig.3 Lung pathology in WT mice and MAPK4-/- mice treated with i.p.10 mg/kg LPS(HE staining)

2.5 MAPK4敲除對ALI模型相關(guān)信號途徑傳遞的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MAPK4-/-小鼠肺臟組織中AKT和ERK變化不顯著(圖5，P>0.05)，但p-AKT和p-JNK的蛋白表達明顯降低(圖5，P<0.01)。

圖4 10 mg/kg LPS腹腔注射后的WT和MAPK4-/-小鼠肺臟組織中相關(guān)炎性細胞因子的mRNA表達水平變化(n=6)Fig.4 Relative mRNA expression of cytokines in lung tissues of WT mice and MAPK4-/- mice treated with i.p.10 mg/kg LPS(n=6)Note:*.P<0.05.**.P<0.01.

圖5 10 mg/kg LPS腹腔注射后的MAPK4敲除對相關(guān)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響(n=6)Fig.5 Change of related signaling pathways in WT mice and MAPK4-/- mice treated with i.p.10 mg/kg LPS(n=6)Note:The expression levels of p-NF-κB，AKT，p-AKT，ERK1/2，p-ERK1/2 and p-JNK in lung tissues were determined with Western blot and calculated.**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

近年來，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族被證實參與機體多種生理病理過程[11-13]。如Schuh等[14]研究發(fā)現(xiàn)，抑制典型MAPK分子ERK1/2可保護LPS誘導(dǎo)的肺損傷；Li等[15]也發(fā)現(xiàn) LPS可通過激活p38/MAPK使內(nèi)皮通透性增加，從而調(diào)節(jié)ALI。這些研究提示深入探討特定MAPK分子在ALI發(fā)生中的作用及其相關(guān)機制不僅是對ALI發(fā)生機理的認識，且對于ALI的臨床預(yù)防和治療均具有重要意義。

MAPK4作為非典型MAPK家族的成員之一，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與腫瘤生成[8,9]。重要的是，有研究報道，與MAPK4有著高度同源結(jié)構(gòu)的ERK3在小鼠肺部發(fā)育中有著重要作用，ERK3的缺失會使小鼠肺部發(fā)育不全，甚至?xí)剐∈笠驗閲乐氐暮粑系K在出生后數(shù)分鐘內(nèi)死亡[16]；然而，MAPK4的缺失并不會影響小鼠肺部發(fā)育[17]。但MAPK4在包括ALI在內(nèi)的肺部疾病中是否存在重要作用還沒有文獻報道。因此，在本研究中，我們利用MAPK4-/-小鼠，首次建立LPS誘導(dǎo)的ALI模型。值得注意的是，MAPK4-/-小鼠誘導(dǎo)ALI模型后生存時間明顯延長；同時，經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)MAPK4-/-小鼠的肺部炎性損傷明顯減輕；Real-time PCR結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，MAPK4-/-小鼠的肺臟組織中，促炎因子IL-β和TNF-α的mRNA表達水平明顯降低，抑炎因子TGF-β的mRNA表達水平明顯增高。這些研究結(jié)果提示MAPK4敲除后可減輕模型小鼠肺部炎癥。此外，已有研究顯示多種免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，也參與了ALI的發(fā)生過程[18-20]。因此，MAPK4是否可通過調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，參與ALI的病理發(fā)生過程還需要進一步深入研究闡明。

現(xiàn)有的研究證實，多條信號通路，如AKT、JNK參與ALI的病理進程[21-23]。如，Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)p-AKT的表達，可明顯改善ALI的病理發(fā)生過程；此外，Xu等[25]也發(fā)現(xiàn)高分子透明質(zhì)酸可以通過抑制p-ASK1及其下游分子p-p38和p-JNK緩解ALI。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，MAPK4敲除后，模型小鼠肺組織中p-NF-κB、AKT、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化；然而p-AKT和p-JNK的蛋白表達水平在MAPK4-/-小鼠中明顯減少，提示MAPK4敲除對ALI發(fā)生的影響可能與AKT和JNK信號途徑傳遞有關(guān)。類似的，Wu等[26]發(fā)現(xiàn)ERK/AKT的激活與胃癌的耐藥性有關(guān)。此外，Salmerón等[27]報道光動力療法治療惡性腫瘤時，p38 MAPK的激活引起細胞凋亡，而JNK促進細胞存活。因此，這些研究提示了MAPKs信號途徑、AKT信號途徑等之間的復(fù)雜聯(lián)系，然而，其確切的分子機制還有待深入研究。

綜上所述，本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)MAKP4敲除后可顯著減輕小鼠ALI模型的肺損傷，為后續(xù)深入研究MAPK4在肺部疾病發(fā)生中的作用以及臨床治療策略的開發(fā)提供了重要的前期實驗依據(jù)。