任路路 韓 蓉 郭 音 范闊海 姜俊兵

(山西農業(yè)大學動物科技學院,太谷030801)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性自身免疫疾病，其特征是進行性的關節(jié)軟骨破壞和骨吸收，造成關節(jié)畸形[1]。RA發(fā)病原因目前尚不完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)RA患者體內T細胞穩(wěn)態(tài)破壞，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cells,Treg)細胞數目下降[2]，而輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)細胞數目上升[3]。類風濕性關節(jié)炎患者體內的Treg細胞和Th17細胞的失衡可能是RA治療的潛在靶點之一[4,5]。Treg細胞通過細胞-細胞接觸和分泌多種細胞因子如白介素10(Interleukin-10,IL-10)和轉化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)抑制自身反應性淋巴細胞，預防自身免疫性疾病的發(fā)生[6]，Treg細胞中特異性的轉錄因子是Foxp3，起控制Treg細胞的生長發(fā)育與免疫活性的作用[7]，Treg細胞數量減少或者Foxp3表達降低均引發(fā)自身免疫性疾病[8]。Treg細胞調控Th17細胞的分化及表型的維持，但類風濕性關節(jié)炎患者中Treg細胞與Th17細胞的平衡被破壞，導致Th17細胞過度活化[9]。Th17細胞是自身免疫性疾病中重要的致病性細胞，抑制Th17細胞的分化或IL-17的產生能顯著緩解多種自身免疫性疾病[10]。RORγt是Th17細胞的關鍵轉錄因子，與白介素23(IL-23)共同作用調控Th17細胞的分化與IL-17的分泌能力[11,12]。在CIA小鼠關節(jié)滑膜中，Th17細胞誘導成骨細胞表達核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)表達，產生破骨細胞導致軟骨腐蝕[13]。

膠原誘導性關節(jié)炎動物模型是廣泛使用的類風濕性關節(jié)炎模型。研究證實，外周T細胞對自身膠原的識別導致T細胞穩(wěn)態(tài)被破壞是CIA小鼠發(fā)病的主要原因[14]，其中Treg細胞與Th17細胞的平衡被破壞，部分Treg細胞在長期炎癥條件下獲得Th17細胞表型，相比Th17細胞對關節(jié)滑膜造成更嚴重的損傷[15]。

泛素結合酶2N(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N,Ubc13)通過T細胞受體(TCR)通路調節(jié)外周T細胞增殖與活化能力，維持T細胞穩(wěn)態(tài)[16,17]。研究證實在CIA小鼠中Ubc13能維持Treg細胞免疫抑制活性，抑制其獲得Th17細胞表型[18]。由此預示Ubc13蛋白對維持CIA小鼠中Treg細胞免疫抑制功能，IL-17、IL-23和RORc等基因的表達，恢復Treg/Th17細胞的平衡，起到一定的治療效果。

本試驗通過CIA小鼠注射鼠源Ubc13重組蛋白研究Ubc13對CIA小鼠體內Treg細胞和Th17細胞數目的影響，以期了解Ubc13對CIA小鼠Treg細胞和Th17細胞平衡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 重組蛋白Ubc13由山西農業(yè)大學臨床獸醫(yī)學試驗室提供[19]；牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑(CFA)購自chondrex公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；2×SYBR Green qPCR Master MIX購自Bimake公司；FITC anti-mouse-CD4 Antibody、PE anti-mouse CD25 Antibody、PE/Cy7 anti-mouse IL-17A Antibody、購自Biolegend公司；Foxp3 Monoclonal Antibody、細胞刺激劑(含蛋白轉運抑制劑)、Foxp3轉錄因子染色套裝、胞內因子染色套裝購自Bioscience公司；SPF級DBA/1雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠模型的建立 將40只6周齡DBA/1雄性小鼠，隨機分為5組，分別為Ubc13低劑量組、Ubc13中劑量組、Ubc13高劑量組、模型組和空白組。所有小鼠自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)1周。將牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑等體積混合，乳化后免疫小鼠，分別對Ubc13低劑量組、Ubc13中劑量組、Ubc13高劑量組和模型組小鼠經尾根部皮下多點注射，100 μl/只；空白組小鼠經尾根部皮下多點注射等量生理鹽水。注射21 d后加強免疫。第2次免疫后，Ubc13低劑量組、Ubc13中劑量組和Ubc13高劑量組分別通過皮下注射Ubc13重組蛋白100 μl/只，Ubc13重組蛋白含量分別為(5 μg、25 μg、50 μg)，每天注射1次，連續(xù)注射21 d；空白組每天注射一次等體積生理鹽水，連續(xù)注射21 d；模型組不做任何處理。第2次免疫后，觀察小鼠RA發(fā)病情況，每周2次記錄關節(jié)炎評分，連續(xù)觀察8周后，解剖小鼠。

1.2.2 關節(jié)炎評分 關節(jié)炎指數評定依據小鼠四肢紅腫的程度和范圍，0分為無紅斑和腫大；1分為踝關節(jié)輕微的紅腫；2分為整個足爪輕微的紅腫；3分為整個足爪中度紅腫；4分為整個足爪重度紅腫。四肢單獨計分，關節(jié)炎評分為四肢分數的總和。

1.2.3 關節(jié)滑膜組織HE染色 將小鼠雙側后肢自膝關節(jié)以上約1 cm處截斷，去除皮膚和肌肉，于Bouin′s固定液中固定24 h，后置于pH7.4 13% EDTA在45℃水浴鍋中脫鈣7 d，每天更換EDTA脫鈣液一次。石蠟切片經HE染色，干燥后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察關節(jié)滑膜組織形態(tài)結構。

1.2.4 脾淋巴細胞分離與刺激 解剖小鼠，無菌取出脾臟，留一小部分凍存，其余部分于超凈臺中用剪刀剪碎，于200目篩上研磨，收集濾下的細胞，紅細胞裂解液處理，收集淋巴細胞，用1 ml含5%血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，除未刺激對照組外，每孔加入2 μl 淋巴細胞刺激劑和轉運抑制劑培養(yǎng)8 h，血細胞計數板計數后，收集1×106個淋巴細胞。

1.2.5 Treg/Th17細胞流式細胞術檢測 在100 μl細胞懸液中加入相應的熒光標記抗體(FITC-CD4、PE-CD25)，混勻，室溫避光孵育20 min；加入2 ml細胞緩沖液混勻，500 g離心5 min，重復1次。

胞外染色后，于樣品中加入1 ml細胞固定液，混勻，室溫下避光固定15 min。固定液洗滌1次。加入2 ml破膜buffer，500 g，離心5 min，重復1次。用100 μl破膜緩沖液，輕柔混勻。加入熒光標記抗體(PE/cy7-IL-17a、APC-Foxp3)，室溫避光孵育30 min。加入2 ml染色buffer，500 g離心5 min，棄上清，重復1次。加入1 ml染色buffer，輕柔混勻，流式細胞儀(BD Accuri C6 plus)檢測分析。

1.2.6 實時熒光定量檢測RORc、IL-17、Foxp3和IL-23 mRNA表達 取凍存小鼠脾臟組織研磨，按照Invitrogen Trizol試劑說明書提取脾臟總RNA，用ND-1000(NanDrop Technologies)測定其濃度，凝膠電泳檢測其完整性。使用TaKaRa公司反轉錄試劑盒進行cDNA合成。采用NCBI工具進行特異性引物設計，交由擎科生物公司合成，引物序列見表1。RORγt由RORc編碼，RORc、IL-17、IL-23的表達水平表示Th17細胞活化程度，F(xiàn)oxp3表達水平表示Treg細胞活化程度。

使用bimake公司SYBR Green qPCR Mix進行熒光定量PCR。反應體系為:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA ≤100 ng，加水至20 μl。反應條件:95℃預變性5 min;95℃ 10 s,60℃ 10 s,72℃ 20 s,40個循環(huán)，72℃ 2 min。GAPDH 作為內參基因，與待檢測樣品共同擴增，每個樣品重復3 次。根據擴增曲線的CT值計算定量結果。通過2-ΔΔCT計算RORc、IL-17、Foxp3和IL-23在對照組和實驗組脾臟中的相對表達水平。GAPDH作為內參基因，與RORc、IL-17、Foxp3和IL-23共同擴增，每個樣品重復3次。

2 結果

2.1 小鼠CIA模型的鑒定與治療效果評價 模型組小鼠在第3天左右后足出現(xiàn)紅腫，在第7天出現(xiàn)前足紅腫，關節(jié)炎評分在14～25 d出現(xiàn)高峰，且其病癥在模型建立56 d后未見顯著減輕。模型組小鼠腫脹關節(jié)不能承重，關節(jié)活動障礙，皮毛雜亂，提示小鼠CIA模型建立成功。Ubc13處理的各組小鼠關節(jié)紅腫出現(xiàn)時間與模型組接近。高劑量組關節(jié)炎病情在第0～33天內較模型組輕微，但Ubc13低劑量組和中劑量組關節(jié)炎評分較模型組無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

表1 本試驗所用引物序列

Tab.1 Primer sequences used in experiment

GenePrimer sequenceRORcF:AAGACTGATTTTCTGCCCCTAGR:TCTATCCCATCTACCCCACAGFoxp3F:GGTACACCCAGGAAAGACAGR:ATCCAGGAGATGATCTGCTTGIL-23F:TGCGATCTCTGATGGCTGTCR:GACGATGTATGGCTGCTGGAIL-17F:TACCTCAACCGTTCCACGTCR:TTTCCCTCCGCATTGACACAGAPDHF:GGTTGTCTCCTGCGACTTCAR:GTCAGGTTTCCCATCCCCAC

圖1 CIA小鼠關節(jié)炎評分表(n=8)Fig.1 CIA mice arthritis score(n=8)Note: Observe the state of the mouse every day,record arthritis score twice a week after second inject collagen，Date are presented as

圖2 模型組小鼠與Ubc13處理各組小鼠關節(jié)HE染色Fig.2 HE staining of mouse joint in model and Ubc13 treatment miceNote: The hind paw from CIA model and Ubc13 treatment mice were decalcificated,then stain by HE.A.Joint section from the control group mice；B.Joint section from the models group mice；C.Low does Ubc13；D.Medium dose；E.High dose mice joint section；Ac.Articular cartilage；Sm.Synovial membrane；Jc.Joint cavity.

圖3 流式細胞術分析脾臟中Treg/Th17細胞的比率 Fig.3 Flow cytometry analysis of Treg cell ratio and Th17 cell ratio in model and Ubc13 treated mice spleensNote: A.FACS plot shows Th17 cells(as reported by CD4-FITC,IL-17A-PE/cy7) among CD4+T cells(CD4+determined by cell surface staining for CD4 protein)；B.Bar graph shows the average percentage of Th17 cells among CD4+Tcell in spleen；C.FACS plot shows Treg cells(as reported by CD25-PE,Foxp3-APC) among CD4+T cells(CD4+determined by cell surface staining for CD4 protein)；D.Bar graph shows the average percentage of Treg cells among CD4+T cell in spleen.For all graphs,date are presented as

圖4 實時熒光定量分析對照組與Ubc13處理組脾臟中RORc、IL-23、IL-17、Foxp3 mRNA的表達量Fig.4 qRT-PCR analysis of expression of RORc，IL-23，IL-17，F(xiàn)oxp3 mRNA in spleens samples collected from control and Ubc13 treatment micesNote: By the real-time PCR amplification plots and melt cruve analysis and judgement,the CT values calculated by analyzed through 2-ΔΔCT.A.The mRNA levels of Foxp3 in CIA model and Ubc13 treatment mices；B.The mRNA levels of RORc in CIA model and Ubc13 treatment mices；C.The mRNA levels of IL-17 in CIA model and Ubc13 treatment mices；D.The mRNA levels of IL-23 in CIA model and Ubc13 treatment mices.Date are presented as (n=8)，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.2 CIA小鼠膝關節(jié)組織病理學檢查 HE染色結果顯示，正常組小鼠關節(jié)軟骨邊緣光滑完整，未見淋巴細胞浸潤與軟骨缺失；模型組小鼠關節(jié)炎滑膜組織重度增生，滑膜層變厚，淋巴細胞浸潤，軟骨重度缺失；Ubc13處理的各組HE染色顯示滑膜增生及淋巴細胞浸潤、軟骨丟失等較模型組輕。見圖2。

2.3 脾臟中Treg細胞和Th17細胞比率 流式細胞術結果顯示，與模型組相比，Ubc13各劑量組均能顯著提高Th細胞中Treg細胞的比率(P<0.01)，且高劑量組能極顯著增加Treg的數目(P<0.001)。與模型組相比，Ubc13處理的各組Th17細胞數目無顯著差異，高劑量組Th17細胞比率有下降趨勢(P>0.05)。見圖3。

2.4 Foxp3、RORc、IL-17、IL-23 mRNA表達水平 Foxp3表達表示Treg細胞分化水平，RORc、IL-17、IL-23表達表示Th17細胞活化水平。實時熒光定量結果顯示，Ubc13處理組Foxp3表達量與模型與空白之間無顯著差異(P>0.05)，高劑量組有升高趨勢。Ubc13處理組各組RORc表達量均低于模型組，其中高劑量組與低劑量組表達量極顯著低于模型組(P<0.001)；Ubc13處理組各組IL-17表達量均低于模型組，其中低劑量和高劑量極顯著低于模型組(P<0.01)；Ubc13處理組各組IL-23表達量均低于模型組(P<0.05)，其中中劑量組與高劑量組mRNA表達量極顯著低于模型組(P<0.001)。見圖4。

3 討論

Treg細胞和Th17細胞的平衡對維持免疫的穩(wěn)態(tài)有重要作用，在CIA小鼠中，部分Treg細胞失去免疫抑制活性，T細胞穩(wěn)態(tài)被破壞，造成多關節(jié)炎癥。小鼠膝關節(jié)HE染色結果顯示，小鼠關節(jié)在造模后56 d關節(jié)病理變化明顯，與郭明等[20]的結果一致，提示CIA模型成功建立。與模型組相比，Ubc13處理組小鼠關節(jié)病癥有一定程度的減輕，提示Ubc13對CIA小鼠關節(jié)有保護作用。

Treg細胞以來源不同分為胸腺來源的自然Treg細胞(nTreg)和外周來源的誘導型Treg細胞(iTreg)[21]，研究證實Ubc13影響CIA小鼠體內外周T細胞的免疫抑制活性，而對胸腺來源T細胞無顯著影響[17]，因此本試驗檢測脾臟中Treg細胞數目。本研究中Ubc13處理的各組小鼠脾臟中Treg細胞比率顯著上升，提示Ubc13對CIA小鼠體內Treg細胞免疫抑制活性有一定的恢復作用，與Chang等[16]的研究結果一致。與模型組相比，空白組Th17細胞比率無顯著差異，提示Ubc13對IL-17蛋白水平表達無顯著影響。

實時熒光定量PCR結果顯示，CIA模型小鼠脾臟中IL-17、IL-23和RORc的表達顯著上升，提示模型組小鼠脾臟中Th17細胞的過度活化。與對照組相比Ubc13處理的各組中IL-17、IL-23和RORc的表達顯著降低。與模型組相比，Ubc13處理組RORc、IL-23和IL-17表達量顯著降低，提示Ubc13通過降低RORc和IL-23的表達抑制Th17細胞的分化與IL-17的產生。

本研究中關節(jié)炎評分結果顯示，模型組關節(jié)炎在二次免疫后開始發(fā)展，在第10天開始達到高峰，病癥維持到二次免疫后56 d未見明顯減輕。Ubc13處理的低劑量組與中劑量組關節(jié)炎評分與模型組無顯著差異，Ubc13高劑量組小鼠關節(jié)炎評分與模型組相比有下降趨勢，提示Ubc13對CIA有一定治療作用，但效果不顯著。

綜上所述，Ubc13處理可導致CIA小鼠體內Treg細胞數目升高，抑制RORc、IL-23和IL-17的表達，減輕小鼠關節(jié)炎病癥，為利用免疫細胞治療類風濕性關節(jié)炎提供了一定的參考。