劉亞芹，楊振斌

（聊城市傳染病醫(yī)院檢驗科，山東 聊城252000）

結(jié)核病是當今全球范圍對人類最具威脅的感染性疾病之一，我國是全世界結(jié)核病負擔最高的國家之一，發(fā)病率全球第三［1］。其中肺結(jié)核占結(jié)核病的比重最大，而控制肺結(jié)核病的有效手段就是實驗室檢查確診病原，當前基層結(jié)核病實驗室所采用的痰涂片敏感性低，痰培養(yǎng)周期長，4～8周，患者往往因待診時間長而貽誤病情，因此探索一種結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）高效的檢測方法，快速準確診斷肺結(jié)核對控制結(jié)核病疫情具有重要意義。核酸恒溫擴增檢測（simultaneous amplification and testing，SAT）技術(shù)，能特異性的檢測MTB的核糖體16SrRNA，通過莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV-RT）、T7 RNA多聚酶和優(yōu)化探針技術(shù)共同來實現(xiàn)高效檢測。本文通過對活動性肺結(jié)核疑似患者的SAT結(jié)果分析，來評價SAT檢測在活動性肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價值。

材料和方法

1 材料

1.1 病例 對2015年7月1日至2017年6月30日來我院就診的僅胸部X線檢查顯示與活動性肺結(jié)核相符的病變患者（活動性肺結(jié)核疑似患者）281例納入分析。

1.2 檢測項目 囑患者留取5mL以上痰標本送檢，標本被平分成3份同時進行中和離心法的MTB的培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測、SAT檢測。AT法的

2 儀器與試劑

2.1 儀器 ①SAT：美國ABI7500實時熒光定量PCR儀，超聲波處理器，高速離心機、混勻儀。②PCR：廈門安普利Genelight2400熒光PCR儀。③中和離心法培養(yǎng)：上海精宏GNP-9270恒溫箱，上海舜宇FA1604型電子天平。

2.2 試劑 ①SAT：上海仁度公司試劑盒，含稀釋液、檢測液、酶（M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA多聚酶）反應(yīng)液等。②熒光PCR：廈門安普利MTB-DNA熒光定性試劑盒。③中和離心法培養(yǎng)：中性羅氏（L-J）培養(yǎng)基，鑒定用對硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基、噻吩-2-羧酸（TCH）培養(yǎng)基。

3 方法

3.1 培養(yǎng)和鑒定 ①中和離心法培養(yǎng)：取2mL痰入離心管，加1～2倍體積的N-乙酰-L半胱胺酸（N-acetyl L-cysteine，NALC）震蕩10s，靜置15min，加磷酸鹽緩沖液40mL，3 000g離心20 min，沉渣兩滴接種中性L-J。②鑒定：將培養(yǎng)物制成10-3mg／mL菌液，分別接種于L-J、PNB、TCH，并設(shè)標準菌株參比，37℃培養(yǎng)4周觀察結(jié)果。

3.2 SAT檢測 1mL痰加等量4%氫氧化鈉（NaOH）震蕩1min，靜置15min，取1mL，13 000r／min離心5min，沉渣加50μL稀釋液，超聲功率300W 15min后，取2μL加30μL擴增檢測液放恒溫儀60℃10min，42℃5min，再加10μL SAT酶液，置ABI7500熒光PCR儀中反應(yīng)。程序：熒光標記選擇羥基熒光素，42℃l min，40個循環(huán)。

3.3 熒光PCR檢測 1mL痰加等量4% NaOH處理20 min，12 000g離心5min，去上清加50μL處理液，96℃10min，12 000g離心5min，10μL入10×PCR擴增系統(tǒng)管，加20μL稀釋液在Genelight 24000熒光PCR儀中擴增，程序：95℃，2min；75℃，15s；52℃，40s，40個循環(huán)。

4 結(jié)果判讀說明

SAT：陽性（0＜dt＜35），陰性（dt＝0或40）。dt為樣本曲線與閾值交點的橫坐標。閾值：閾值線為剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

PCR：陽性（0＜ct＜35），陰性（ct＝0或40）。ct為樣本曲線與閾值交點的橫坐標。臨界陽性ct大于強陽性對照的ct值，并小于38。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，對兩種方法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的比較采用配對四格表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

在281例經(jīng)X射線檢查顯示與活動性肺結(jié)核疑似的患者中通過PNB、TCH鑒定出12例非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculousmycobacteria，NTM）。對這12例非結(jié)核分枝桿菌，中和離心法培養(yǎng)、SAT均檢測為陰性，只有PCR檢測為1例MTB陽性，后經(jīng)基因測序鑒定為堪薩斯分枝桿菌（重做了PCR結(jié)果為陰性，考慮PCR的污染導(dǎo)致）。除去這12例NTM，其他269例患者，中和離心法培養(yǎng)、PCR、SAT的檢測MTB陽性的例數(shù)分別為179、190、189，這三種檢測方法陽性率最高的為PCR 70.6%，SAT為70.3%，與PCR非常接近，培養(yǎng)法的陽性率最低為66.5%。

以中和離心法培養(yǎng)為金標準，PCR與中和離心法培養(yǎng)的結(jié)果比較如下表1所示。

表1 PCR與中和離心法培養(yǎng)檢測MTB結(jié)果的比較

根據(jù)表1的結(jié)果，經(jīng)卡方分析，χ2＝4.8，P＝0.029，說明PCR與中和離心法培養(yǎng)兩種方法在MTB檢測中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PCR檢測MTB的靈敏度為97.2%，特異性為82.2%。SAT檢測與PCR檢測MTB的結(jié)果比較如表2所示：

表2 SAT與PCR-DNA檢測MTB的結(jié)果比較

以中和離心法培養(yǎng)為金標準，SAT檢測與中和離心法培養(yǎng)檢測MTB結(jié)果顯示SAT檢測MTB的靈敏度為98.3%，特異性為85.6%，經(jīng)卡方分析，χ2＝5.1，P＝0.024，說明SAT與中和離心法培養(yǎng)在MTB檢測中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

結(jié)核病的診斷方法目前主要包括痰涂片鏡檢、培養(yǎng)法、免疫學(xué)、分子診斷技術(shù)等［2-3］。培養(yǎng)雖是檢測MTB的金標準，但耗時長，中和離心法的培養(yǎng)需時3～8周，當前PCR在MTB的檢測中應(yīng)用較多，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加，從而更容易準確診斷肺結(jié)核［4］。已有研究報道，PCR檢驗在肺結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用價值較高且準確率較高［5-6］。PCR操作中仍需特別注意實驗器材的污染問題，以免出現(xiàn)結(jié)果假陽性，本研究中PCR在檢測12例NTM時也出現(xiàn)了這個情況。又因細菌L型由于缺壁并有代償性細胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細胞膜破裂釋放出DNA，以致造成PCR檢測的假陰性。本研究中，在269例活動性肺結(jié)核疑似患者中，SAT檢測MTB的靈敏度（98.3%）和特異性（85.6%）均高于PCR的特異性（97.2%）和靈敏度（82.2%）。SAT技術(shù)是第二代核酸檢測技術(shù)，靶標RNA在RT酶作用下經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成一條帶T7啟動子的雙鏈DNA，T7 RNA聚合酶以這條雙鏈DNA為模板不斷地合成RNA，新合成的RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄過程又可以合成雙鏈DNA，如此往復(fù)，以此達到擴增的目的。SAT檢測結(jié)核菌核糖體RNA，核糖體RNA的含量在每個結(jié)核菌里面達到了2 000個拷貝，所以MTB-SAT檢測的靈敏度非常高，SAT還利于療效評估，患者在用藥后，病原體死亡，RNA隨之降解，所以RNA檢測是活菌檢測，檢測結(jié)果直觀反映結(jié)核菌在體內(nèi)的存活狀態(tài)，利于臨床用藥治療效果的評估。RNA容易降解，也不易造成實驗室的后續(xù)污染。綜合來看，以16s RNA為靶標的SAT技術(shù)在不同程度上提高了檢測結(jié)果的靈敏度和精確度，2～3 h即可獲得檢測報告［7-8］。而且SAT檢測試驗要求較熒光PCR擴增法低，恒溫反應(yīng)，耗時短，成本低，值得在MTB檢測中推廣應(yīng)用。