劉玉蘭，吳允鳳，高川川，孫艷艷

（首都醫(yī)科大學石景山教學醫(yī)院，北京市石景山醫(yī)院，北京100043）

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸代謝的關鍵酶，葉酸代謝相關基因多態(tài)性可以導致葉酸血藥濃度水平差異較大，通過檢測患者葉酸代謝相關基因多態(tài)性以及葉酸和同型半胱氨酸（Hcy）的水平，評估葉酸代謝能力，可以為患者制訂個體化的葉酸補充方案。根據(jù)國家衛(wèi)生計生委2015年頒布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）》（簡稱指南）要求，無論是使用經(jīng)國家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準的試劑盒還是通過國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學檢測試點單位性能評定、具有嚴格標準操作規(guī)程（SOP）的自制試劑（laboratory developed test，LDT）進行的檢測項目，醫(yī)學實驗室在開展臨床檢測前都需要對其進行性能驗證，并建立相應的性能規(guī)范，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準和質(zhì)控程序相關活動的記錄，以保證檢測結(jié)果的準確、可靠［1］。同時，對選用試劑進行性能驗證也是北京市臨床基因擴增實驗室技術評審的考核條件之一。本文旨在對該實驗室選用的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒的性能進行驗證，以確保其性能滿足醫(yī)學實驗室的要求。

資料與方法

1 一般資料

選取2017年10月來北京市石景山醫(yī)院心臟內(nèi)科門診就診的高血壓患者20例，采集患者EDTA-K2抗凝靜脈血2mL。

2 儀器與試劑

TL-988型熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司），3730XL型測序儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒（熒光PCR法）（蘇州曠遠生物分子技術有限公司，國械注準20173403239）及配套的核酸提取純化試劑盒。

3 方法

3.1 準確性 對20例標本的MTHFR基因多態(tài)性進行檢測，將結(jié)果與測序（金標準）結(jié)果進行比較，以驗證試劑盒的準確性。

3.2 精密度 采用實時熒光PCR對雜合型標本重復擴增10次，以驗證試劑盒的精密度。

3.3 最低檢測限 將廠家提供的雜合型DNA標本（已知濃度為19.8ng/μL）用蒸餾水進行倍比稀釋至檢測限（10ng/μL）下的濃度9.9 ng/μL，重復檢測3次，以驗證試劑盒的最低檢測限。

結(jié) 果

1 準確性

20例標本的MTHFR基因多態(tài)性檢測結(jié)果見圖1～圖3，包括野生型（CC）5例，雜合突變型（CT）8例和純合突變型（TT）7例，實時熒光PCR的檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全符合，符合率為100%（20/20）。

圖1 野生型CC實時熒光PCR與Sanger測序法結(jié)果比較

圖2 雜合突變型CT實時熒光PCR與Sanger測序法結(jié)果比較

圖3 純合突變型TT實時熒光PCR與Sanger測序法結(jié)果比較

2 精密度

批內(nèi)重復10次的分型檢測結(jié)果與實際基因型完全相符，且所有通道的CT值變異系數(shù)CV≤5%，見表1。

表1 實時熒光PCR Ct值的批內(nèi)CV（%）

3 最低檢測限

稀釋到檢測限下的三次重復實驗均能準確進行分型。

討 論

研究表明，高同型半胱氨酸血癥是冠心病的獨立危險因素［2］，其高水平可能與高血壓病的發(fā)病相關。血漿中同型半胱氨酸水平是由營養(yǎng)狀況和遺傳因素共同決定的。而基因方面最主要的決定因素是MTHFR基因C677T基因多態(tài)性。1988年，KANG S S等［3］的研究就認為MTHFR基因第677位堿基對上的丙氨酸替代纈氨酸的突變是一種常見突變，且該突變會影響血漿Hcy的代謝，導致高同型半胱氨酸血癥和低葉酸水平。

研究指出，葉酸缺乏和高Hcy與習慣性流產(chǎn)和一些不良妊娠事件（如妊娠誘發(fā)的高血壓、先兆子癇和胎盤早剝等）有關［4］。葉酸缺乏可導致胚胎NTD（神經(jīng)管畸形）和先天性心臟畸形［5］。ZINTZARASE等的研究肯定了MTHFR C677T基因多態(tài)性與唐氏綜合征的相關性［6］。

此外，文獻報道MTHFR基因677 C-T突變還是2型糖尿病、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病、白血病、結(jié)腸癌、深靜脈血栓和精神焦慮、抑郁等疾病的風險因子［7］。

MTHFR基因C677T基因多態(tài)性會導致機體對葉酸的吸收代謝能力存在個體差異，使用相同劑量治療易導致預期療效降低或無效，因此，檢測基因多態(tài)性，估算葉酸代謝能力，并據(jù)此調(diào)整葉酸補充劑量的個體化用藥很有必要。

MTHFR基因多態(tài)性檢測屬于定性檢測項目，參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的EP12-A2文件，定性檢測方法的性能驗證指標主要包括重復性/精密度、準確性（突變型的檢測能力）和檢測限3個方面［8］。

依據(jù)以上要求，本文對該試劑盒進行了準確性、精密度和檢測限的驗證。根據(jù)指南中的要求，準確性的評價有兩種方法：一種是直接檢測已知標準的標準物質(zhì)，將檢測結(jié)果與已知標準值進行比較；另一種是同時采用待評估項目與標準方法（或參考方法）對同一批次樣品進行分析，比較二者的檢測結(jié)果［1］，本文采用后者，將20例標本的MTHFR基因多態(tài)性檢測結(jié)果，與金標準-測序結(jié)果進行比較，結(jié)果完全符合；定性項目的精密度是指一份陽性或陰性樣本在多次檢測中，是否能得到可重復的陽性或陰性結(jié)果，本文中，重復擴增10次的分型檢測結(jié)果與實際基因型完全相符，且所有通道的CT值變異系數(shù)CV≤5%，表明檢測體系的重復性高；檢測限是指可被檢測體系檢出的最低檢測濃度，又稱最小檢測濃度或檢測底限，本文中，稀釋到檢測限（10ng/μL）下的濃度9.9 ng/μL的三次重復實驗均能準確進行分型，表明試劑盒具有足夠的檢測能力。

通過驗證，確認試劑盒的性能已經(jīng)達到了生產(chǎn)商說明書上聲稱的檢測要求，可以應用于醫(yī)學實驗室，為臨床提供準確、可靠的結(jié)果。