竇金金, 陳紅影, 劉 莉, 謝 寧, 胡勝南, 李雪超, 陳 凱, 張喜武*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱150040)

血管性癡呆是由一系列腦血管病導(dǎo)致的以認(rèn)知、記憶功能減退為主,伴有語(yǔ)言、視空間辨別技能、情感人格障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性損害疾病［1］,是迄今唯一可預(yù)防的癡呆類型,炎性反應(yīng)參與其發(fā)生發(fā)展［2-5］。腦缺血損傷后,在受損區(qū)有大量炎性因子(黏附分子、細(xì)胞因子和補(bǔ)體活化因子等) 表達(dá)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［6］,故干擾炎癥過(guò)程某些環(huán)節(jié),降低炎癥反應(yīng)損害,可能成為治療腦缺血后神經(jīng)元變性損傷的有效方法。近年來(lái),中藥在血管性癡呆防治上日益顯示出優(yōu)勢(shì),多種相關(guān)制劑已應(yīng)用于臨床治療中,并取得一定療效［7］,因此,本實(shí)驗(yàn)觀察黃連溫膽湯對(duì)血管性癡呆大鼠炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料

清潔級(jí)健康Wistar 大鼠100 只,雄性,體質(zhì)量(200±10) g,許可證號(hào)2017023521,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周,室溫、濕度分別維持在22～26 ℃、55%左右,正常光照,飲水及飼料經(jīng)高溫蒸汽滅菌。加減黃連溫膽湯由黃連溫膽湯(黃連9 g、半夏12 g、陳皮10 g、茯苓18 g、竹茹6 g、枳實(shí)6 g、甘草6 g、生姜6 g) 加減而成,藥材購(gòu)于哈爾濱松茂藥材公司,加水煎煮3 次,藥液質(zhì)量濃度1 g/mL 作為高劑量組,稀釋1/2 濃度作為低劑量組,保存于4 ℃冰箱中備 用, 給 藥 體 積 為 2 mL/100 g。 鹽 酸 多 奈 哌 齊 片(5 mg/片)。DMS-2MORRIS 水迷宮系統(tǒng)；JEM-1220 型透射電鏡(日本電子公司)；BX60 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；cimas Med6.0 病理圖像分析系統(tǒng)；702 超低溫冰箱；電熱恒溫干燥箱。Rabbit Anti-Tumor Necrosis Factor α；COX2 Rabbit Anti-COX2；PV6001 二步法免疫組化試劑盒；TRIzol 試劑；瓊脂糖；PBS 緩沖液；檸檬酸鈉；硝普鈉；0.1 mmol/L 4%多聚甲醛(調(diào)pH 為7.4)。

2 方法

2.1 分組 100 只Wistar 大鼠隨機(jī)分成6 組,即空白組(15 只)、假手術(shù)組(17 只)、模型組(17 只)、鹽酸多奈哌齊片組(17 只)、加減黃連溫膽湯低劑量組(17 只)、加減黃連溫膽湯高劑量組(17 只)。

2.2 造模 10%烏拉坦(10 mg/kg) 麻醉大鼠后,沿腹側(cè)頸正中切開(kāi),分離頸迷走和交感神經(jīng),暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾關(guān)閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,20 min 后再通10 min,再夾閉20 min,重復(fù)3 次。造模組在松開(kāi)雙側(cè)頸總動(dòng)脈前先腹腔注射2.5 mg/kg 硝普鈉以造成大腦缺血再灌注損傷,隨后縫合傷口,放回籠中保溫飼養(yǎng)；假手術(shù)的麻醉及手術(shù)過(guò)程與造模組相同,但不阻斷頸總動(dòng)脈、不注射硝普鈉。

模型篩選標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)術(shù)后3 d 存活的造模大鼠進(jìn)行訓(xùn)練,以空白組大鼠逃避潛伏期平均值為參考,計(jì)算模型組大鼠平均逃避潛伏期與其差值占平均逃避潛伏期的比例,＞20%為癡呆,20%～30%為輕度癡呆,30%～40%為中度癡呆,＞40%為重度癡呆。達(dá)不到癡呆標(biāo)準(zhǔn)者被剔除出實(shí)驗(yàn)。

2.3 給藥 各組大鼠灌胃給藥28 d,鹽酸多奈哌齊片組按照0.45 mg/kg 劑量給藥,空白組、假手術(shù)組、模型組給予同體積蒸餾水。

2.4 取材 造模后第28 天在水迷宮實(shí)驗(yàn)后,每組取5 只大鼠用于灌注固定,10%烏拉坦(10 mg/kg) 麻醉后剖開(kāi)胸腔,暴露心臟,經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈插管,先以預(yù)冷的0.9%生理鹽水100～200 mL 速灌沖洗,同時(shí)剪開(kāi)右心耳直至流出液體變清,待大鼠雙目虹膜以及肝臟變白后,插管內(nèi)灌入預(yù)冷的4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS 緩沖液配制,pH 7.4)200～400 mL,30 min 內(nèi)灌完,開(kāi)顱取全腦,置于新配制4%多聚甲醛液(4 ℃) 中固定,供光鏡觀察使用。另取2 只大鼠,迅速分離海馬后置于2.5%戊二醛溶液中固定,供電鏡觀察使用。

2.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 將平臺(tái)放在第四象限,在其他3個(gè)象限任選1 點(diǎn)面向水池池壁,將大鼠放入水中,每天每個(gè)象限各測(cè)試1 次,每次1 min。若大鼠在1 min 內(nèi)尚未找到平臺(tái),則將其拿到平臺(tái)上并在上面站10 s,則其潛伏期為1 min；若在1 min 之內(nèi)找到平臺(tái),也讓其在平臺(tái)上站10 s,如此訓(xùn)練4 d,記錄大鼠分別在3 個(gè)象限找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即潛伏期),計(jì)算平均值。

2.6 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

2.6.1 尼氏體染色 大鼠行為學(xué)測(cè)試后,4%多聚甲醛灌注固定,取全腦于新配制的4%多聚甲醛中固定1 h→取視交叉后至小腦前4 mm 處進(jìn)行修塊,固定1 ～2 h→70%～100%乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋→由尾側(cè)向頭側(cè)行冠狀連續(xù)切片5 張,厚度5 μm,裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上→60 ℃恒溫烘箱中烘片12 h→石蠟切片經(jīng)二甲苯逐級(jí)脫蠟水化。尼氏體甲苯胺藍(lán)染色,100%～70%酒精脫水二甲苯透明,樹(shù)脂封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化,神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)含有紫蘭色顆粒是尼氏體。

2.6.2 腦海馬超微結(jié)構(gòu) 將剝離的大鼠海馬組織置于2.5%戊二醛液中固定,4 ℃下保存,0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS) 沖洗,0.1%鋨酸固定,三蒸水連續(xù)沖洗,50%、70%、90%、100%丙酮逐級(jí)脫水,室溫下包埋劑浸透過(guò)夜,包埋修塊,半薄切片HE 染色,精確定位,超薄切片,電子染色,于透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

2.7 海馬TNF-α、COX-2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化(PV 二步法)。大鼠腦組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟除水,3%H2O2孵育5 min,消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性,對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理：0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液(pH ＝6.0) 微波修復(fù),TNF-α 不進(jìn)行預(yù)處理,蒸餾水沖洗；滴加一抗(1 ∶50),濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜,PBS 沖洗,2 min×3 次；滴加二抗(山羊抗兔) 工作液,室溫下反應(yīng)20 min,PBS 沖洗,2 min×3 次；DAB 顯色,光鏡下觀察,蒸餾水沖洗阻斷顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染2 min。逐級(jí)酒精脫水(80%、90%、95%、100%,每次2 min),二甲苯透明,樹(shù)脂封片。陰性對(duì)照為一抗加PBS。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用表示,逃避潛伏期組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的多因素方差分析,其他指標(biāo)組間比較正態(tài)分布定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠潛伏期的影響

表1 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠潛伏期的影響

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與空白組比較,▲▲P＜0.01；與模型組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)/只 第1 天 第2 天潛伏期/s第3 天 第4 天空白組 15 33.80±3.69△△ 31.42±3.22△△ 30.08±3.65△△ 28.10±3.48△△假手術(shù)組 16 36.79±3.40△△ 35.31±4.34△△ 27.08±6.93△△ 28.64±4.92△△模型組 15 56.80±5.27** 55.20±5.40** 53.22±4.89**▲▲ 47.81±5.69**鹽酸多奈哌齊片組 16 47.15±5.56*△ 38.27±4.06△△ 34.01±5.14△△ 31.64±4.70△△加減黃連溫膽湯低劑量組 15 47.24±6.86*△ 37.76±5.44△△ 34.61±4.27△△ 32.23±5.78△△加減黃連溫膽湯高劑量組 16 49.24±7.85** 36.78±6.22△△ 32.94±3.49*△△ 30.08±6.46△△

3 結(jié)果

3.1 大鼠死亡情況 在給藥階段,假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊片組及加減黃連溫膽湯低、高劑量組大鼠死亡數(shù)分別為1、2、1、2、1 只。

3.2 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠潛伏期的影響 表1 顯示,第1 天模型組、鹽酸多奈哌齊片組、加減黃連溫膽湯組大鼠潛伏期顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05,P＜0.01)；第2～4 天模型組大鼠潛伏期顯著高于其他組(P＜0.01),而鹽酸多奈哌齊片組、加減黃連溫膽湯組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

3.3 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 圖1 顯示,空白組、假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體豐富,核呈清晰藍(lán)色,有大有小,呈三角形、橢圓形或不規(guī)則形；模型組大鼠皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體模糊不清,數(shù)量明顯減少近乎消失；給藥組大鼠皮層神經(jīng)元病變均明顯輕于模型組,部分神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體減少或消失,以鹽酸多奈哌齊片組改善最明顯,加減黃連溫膽湯高、低劑量組次之。

3.4 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 圖2 顯示,空白組、假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核膜完整,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,嵴突完整而無(wú)破壞,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整齊,可見(jiàn)高爾基復(fù)合體及溶酶體；模型組大鼠神經(jīng)元胞體固縮,核膜模糊、皺縮,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹囊性擴(kuò)張、減少且結(jié)構(gòu)模糊,溶酶體略有增多,高爾基復(fù)合體消失；給藥組大鼠神經(jīng)元病變均明顯輕于模型組,神經(jīng)元內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有所變化,其中鹽酸多奈哌齊片組略有減少,加減黃連溫膽湯低劑量組明顯減少,加減黃連溫膽湯高劑量組明顯增多,均有少數(shù)高爾基氏器及溶酶體。

3.5 加減黃連溫膽湯對(duì)大鼠海馬TNF-α、COX-2 表達(dá)的影響 TNF-α 免疫組化檢測(cè)顯示,模型組大鼠海馬組織細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色,陽(yáng)性染色細(xì)胞密集；給藥組大鼠腦組織細(xì)胞染色淺淡,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少；空白組、假手術(shù)組大鼠陽(yáng)性表達(dá)很少。COX-2 免疫組化檢測(cè)顯示,模型組大鼠海馬組織細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色,陽(yáng)性染色細(xì)胞密集；給藥組大鼠腦組織細(xì)胞染色淺淡,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少；空白組、假手術(shù)組大鼠陽(yáng)性表達(dá)很少。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)尼氏染色（×400）

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)（×11 500）

表2 顯示,模型組TNF-α 表達(dá)陽(yáng)性面積、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.01),而加減黃連溫膽湯組兩者較模型組顯著降低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠海馬TNF-α 表達(dá)面積的比較n=5）

表2 各組大鼠海馬TNF-α 表達(dá)面積的比較n=5）

注：與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△P＜0.05

組別 TNF-α空白組 0.009 6±0.001 1假手術(shù)組 0.010 9±0.001 4模型組 0.033 2±0.000 5**鹽酸多奈哌齊片組 0.024 8±0.001 9**△加減黃連溫膽湯低劑量組 0.025 4±0.001 6**△加減黃連溫膽湯高劑量組 0.023 8±0.001 8**△

表3 顯示,模型組COX-2 表達(dá)陽(yáng)性面積、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.01),而加減黃連溫膽湯組兩者較模型組顯著降低(P＜0.05)。

表3 各組大鼠海馬區(qū)COX-2 表達(dá)面積的比較（n=5）

表3 各組大鼠海馬區(qū)COX-2 表達(dá)面積的比較（n=5）

注：與假手術(shù)組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△P＜0.05

組別 COX-2空白組 0.016 7±0.003 3假手術(shù)組 0.019 0±0.004 8模型組 0.032 7±0.004 8**鹽酸多奈哌齊片組 0.025 2±0.001 5**△加減黃連溫膽湯低劑量組 0.026 1±0.004 2**△加減黃連溫膽湯高劑量組 0.025 4±0.003 8**△

4 討論

血管性癡呆疾病的全球發(fā)病率日益增長(zhǎng),記憶和認(rèn)知功能障礙是其主要表現(xiàn),通常由腦缺血和缺氧損傷引起［8］。近年來(lái)研究表明,炎癥反應(yīng)與腦組織損傷、腦組織缺血缺氧程度、再灌注密切相關(guān)［9］,炎性損傷是血管性癡呆重要病理機(jī)制,腦缺血損傷引起多種炎性因子上調(diào),如細(xì)胞間黏附分子1、 環(huán)氧合酶2 (COX-2)、 一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1β 等［10-11］,并且腦缺血后海馬中TNFα、IL-1β 表達(dá)增加也與其發(fā)生密切相關(guān)［12-13］。

血管性癡呆屬于中醫(yī)“呆病” “文癡” “郁癥” “癲癥” “健忘” 等范疇,其病位在腦,近年來(lái)中醫(yī)學(xué)者不斷深入研究［14］,認(rèn)為痰濁蒙竅是本病病理關(guān)鍵,瘀血痰濁貫穿始終,而痰瘀互結(jié),久滯不化,釀毒損髓,敗壞腦絡(luò)則是其發(fā)生及演變的核心環(huán)節(jié)［15］。黃連溫膽湯由溫膽湯加黃連而成,出自《六因條辨》,該方所治之病證在于“痰”,本實(shí)驗(yàn)在其基礎(chǔ)上進(jìn)行加減,共奏清熱化痰、活血化瘀之功,方中半夏燥濕化痰；陳皮、黃芪、茯苓益氣健脾,理氣解郁,化痰除濕,以絕生痰之源；決明子清肝膽之熱,潤(rùn)腸通便,脾胃自和；黃連入心經(jīng)以解神明之毒；竹茹清熱化痰；葛根解陽(yáng)明之郁熱,清熱生津,防止諸藥溫燥傷陰；丹參活血化瘀,祛除瘀阻之邪；黃芪補(bǔ)氣,以帥血行,增強(qiáng)丹參活血之效；甘草,益脾和中,調(diào)和諸藥。

腦組織缺血及缺血再灌注時(shí),神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞等被激活,釋放出炎性因子IL-1β 和TNF-α,進(jìn)而刺激其他細(xì)胞因子釋放,加重腦缺血損傷［16］,其中后者在觸發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程中處于中心地位［17］,并可協(xié)同前者誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子產(chǎn)生［18］,而且兩者均可誘導(dǎo)癡呆發(fā)生［19］。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,加減黃連溫膽湯組大鼠腦組織炎癥反應(yīng)較模型組明顯減輕,可能通過(guò)某種機(jī)制減少COX-2 表達(dá),或有可能通過(guò)對(duì)前炎癥細(xì)胞因子(IL-1β 和TNF-α) 的抑制作用而發(fā)揮對(duì)COX-2 表達(dá)的干預(yù)作用,最終抑制腦缺血后炎癥反應(yīng),發(fā)揮腦保護(hù)作用。模型組大鼠TNF-α 陽(yáng)性面積、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較空白組、假手術(shù)組明顯增強(qiáng),提示缺血再灌注后可激發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng),細(xì)胞因子TNF-α 表達(dá)增強(qiáng)；加減黃連溫膽湯組TNF-α 陽(yáng)性面積、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較模型組明顯下降,即腦組織炎癥反應(yīng)明顯減輕,可能是由于通過(guò)抑制其導(dǎo)致的自身毒性環(huán)路,加之減少興奮性氨基酸釋放、抑制NO 生成及白細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)等作用,共同減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述,加減黃連溫膽湯可改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙,其機(jī)制可能是該方可降低海馬組織中TNFα、COX-2 表達(dá),從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。