袁強華, 呼 梅, 談 靜

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都610072)

湯劑是中醫(yī)臨床普遍廣泛的用藥方式［1］,但其煎煮耗時長、流程繁雜、質(zhì)量難控制及參差不齊等缺點影響了患者對中醫(yī)藥的認同感。近年來,隨著科技發(fā)展和技術(shù)進步,也出現(xiàn)了一些新的不同形式中藥飲片,如配方顆粒、超微飲片、破壁飲片等［2］,在一定程度對傳統(tǒng)飲片進行了有的補充,有著積極的臨床意義,但也存在明顯的問題,如標準不明確、劑量不統(tǒng)一、缺乏臨床使用合理性證明等［3］,給市場監(jiān)管帶來了困擾。為了解決上述問題,以陳士林為首的研究人員提出了中藥飲片標準湯劑的理論,旨在提高臨床用藥準確性、療效一致性、用藥安全性［4］。

化扁方作為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床治療急性化膿性扁桃體炎、急性咽炎的經(jīng)驗方,由川銀花、連翹、黃芩、牛蒡子、竹葉柴胡、薄荷、浙貝母、皂角刺、天花粉、魚腥草10 種藥味組成。本實驗在前期綠原酸類(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C)、黃酮類(黃芩苷)、木脂素類(連翹苷、牛蒡苷) 成分定量分析的基礎(chǔ)上［5］,對化扁方在5、10、15 倍加水量下不同煎煮時間點上述成分含有量進行檢測,繪制含有量/煎煮時間動態(tài)分布趨勢圖,探索影響其煎煮效果的關(guān)鍵工藝參數(shù),再采用正交試驗優(yōu)化,以期為該方標準湯劑制備工藝規(guī)范確定及后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀(配置四元泵、DAD、在線脫氣、OpenLAB 工作站,美國安捷倫科技公司)；BP211D 電子分析天平(十萬分之一,瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥 綠原酸 (批號110753-201313, 含有量96.6%)、咖啡酸(批號110885-200102,含有量100%)、黃芩苷 (批號110715-201318,含有量93.3%)、連翹苷(批號110821-201213, 含有量95.3%)、 牛蒡苷 (批號110819-201007,含有量95.4%) 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批號170809,含有量98.9%)、隱綠原酸 (批號170809,含有量99.2%)、異綠原酸B(批號170102, 含有量98.8%)、 異綠原酸A (批號171010,含有量98.8%)、異綠原酸C(批號170102,含有量99.1%) 對照品均購自成都植標化純生物技術(shù)有限公司。乙腈為色譜純(美國天地公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 含有量測定［3］

2.1 色譜條件 島津Insertsustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.2%磷酸(B),梯度洗脫(0 ～18 min,10%A；18 ～21 min,10%→23%A；21～50 min,23%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長327 nm(0～37 min,新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C)、278 nm(37～41.3 min,黃芩苷)、228 nm(41.3 ～50 min,連翹苷、牛蒡苷)；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品新綠原酸10.21 mg、綠原酸20.45 mg、隱綠原酸10.13 mg、咖啡酸10.33 mg、異綠原酸B 10.15 mg、異綠原酸A 10.33 mg、異綠原酸C 10.27 mg、黃芩苷49.55 mg、連翹苷10.12 mg、牛蒡苷10.23 mg,置于50 mL 棕色量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,各精密吸取2 mL,置于25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取水煎液2 mL,置于25 mL量瓶中,50%甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

3 含有量-煎煮時間動態(tài)分布趨勢

按處方比例稱取藥材約300 g,置于三口圓底燒瓶中,分別加5、10、15 倍量水浸泡透心,回流提取,分別在沸騰 后 15、 30、 45、 60、 75、 90、 105、 120、 135、 150、165、180 min 各取藥液10 mL,同時補加同溫介質(zhì)10 mL,藥液過濾,放冷,各精密吸取2 mL 于25 mL 棕色量瓶中,甲醇定容,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下測定,并繪制含有量-煎煮時間動態(tài)分布趨勢圖,見圖1。

圖1 各成分含有量-煎煮時間動態(tài)分布趨勢

由圖可知,同一加水量下,綠原酸類、黃酮類、木脂素類成分含有量-煎煮時間趨勢一致；不同加水量下,綠原酸類、木脂素類成分含有量依次為5 倍＜10 倍＜15 倍,黃酮類成分依次為5 倍＜15 倍＜10 倍；綠原酸類成分含有量在煎煮45 min 后達到平衡,而黃酮類、木脂素類分別在煎煮60、150 min 后；綠原酸類成分含有量在煎煮時間15 ～180 min內(nèi)均呈下降趨勢,而且損失率與加水量一致。

4 制備工藝優(yōu)化

圖1 顯示,影響煎煮效果的因素為加水量、煎煮時間,故對其進行優(yōu)化。將提取次數(shù)設(shè)定為3 次,其中第1、3 次煎煮時間的3 個水平分別為10、15、20 min,第2 次分別為30、40、50 min；加水量3 個水平分別為5、10、15 倍。再采用正交試驗,以總綠原酸(包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C)、黃芩苷、連翹苷、牛蒡苷含有量及總固形物率的綜合評分為評價指標(根據(jù)藥效成分來源藥材在處方中的比例,擬定 其 權(quán) 重 系 數(shù) 分 別 為 0.176、 0.088、 0.176、 0.088、0.472) 優(yōu)化煎煮工藝,因素水平見表1。

表1 因素水平

按處方比例稱取全部藥材約170 g,浸泡30 min 后將藥液減壓濃縮至1 000 mL,作為供試品藥液,取適量測定。結(jié)果見表2,方差分析見表3。由表2 可知,各因素影響程度依次為加水量(A) ＞第2 次煎煮時間(C) ＞第1 次煎煮時間(B) ＞第3 次煎煮時間(D),根據(jù)綜合評分極差顯示最優(yōu)工藝為A3B3C3D3；由表3 可知,除A 因素(P＜0.05) 外其他3 個因素無顯著影響(P＞0.05)。由此確定,最優(yōu)工藝為A3B1C1D1,即加15 倍量水煎煮3 次,煎煮時間15、30、15 min。

按處方比例稱取3 份藥材,質(zhì)量分別為170、510、1 630 g,浸泡30 min,按照優(yōu)化工藝操作,分別減壓濃縮至1 000、3 000、9 000 mL,進行3 批驗證試驗,結(jié)果見表4。由表可知,9 份樣品各指標RSD 均小于5%,表明工藝合理可行。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

表4 驗證試驗結(jié)果（n=3）

5 討論

關(guān)于標準湯劑的研究大多針對單味中藥,但臨床應(yīng)用中復(fù)方湯劑才是主要形式。在傳統(tǒng)復(fù)方湯劑制備時大多依據(jù)主觀經(jīng)驗,缺乏對全方整體性考慮,其加水量和煎煮時間不盡合理,導(dǎo)致臨床療效出現(xiàn)偏差,如加水量偏少或煎煮時間過短,藥效成分煎出率不足；煎煮時間過長,不耐熱藥效成分發(fā)生降解等［6］。因此,標準湯劑制備既要借鑒傳統(tǒng)湯劑,更要對對后者合理性進行探討,從而得出關(guān)鍵工藝參數(shù)(加水量、煎煮時間) 量化值［4］。

圖1B 顯示,在180 min 內(nèi)綠原酸含有量隨著煎煮時間延長逐漸降低,其原因時該成分為咖啡酸奎尼酸酯,在pH值2.0～3.0 或3.0 ～8.0 時,分別能被酸或堿催化發(fā)生水解［7］。不同加水量下化扁湯藥液pH 值介于4.3 ～4.8 范圍內(nèi),符合綠原酸被堿催化發(fā)生水解反應(yīng)的要求,,同時料液比由1 ∶5 升至1 ∶15,其損失率也增大。

圖1B、1 J 顯示,加水量15 倍時綠原酸含有量在煎煮15 min 后與10 倍基本一致,但在15 ～180 min 范圍內(nèi)的損失率均高于后者；黃芩苷含有量在煎煮15 min 后與10 倍加水量基本一致,但在15～180 min 范圍內(nèi)含有量均低于后者,這與增加溶劑量促進其溶出的預(yù)期結(jié)果相反,該成分為黃酮類化合物,含游離酚羥基而顯酸性,易與堿性物質(zhì)結(jié)合加速溶出［8-10］,但加水量15 倍時更多堿性物質(zhì)參與綠原酸堿催化水解反應(yīng),而與其結(jié)合量隨之減少,影響了溶出,導(dǎo)致其溶出速率下降。

由圖1E、1F、1G、1H 可知,180 min 內(nèi)異綠原酸A、異綠原酸C 含有量隨著煎煮時間延長逐漸降低,而異綠原酸B 逐漸增高,三者總含有量在煎煮時間45～180 min 內(nèi)基本平衡,其原因是它們受溫度影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,體現(xiàn)為前兩者轉(zhuǎn)化為后者［11］。