吳玉婷, 呂偉旗, 湯晟凌,2*

(1.麗水市人民醫(yī)院,浙江 麗水323000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州310053)

顛茄草系茄科多年生草本植物顛茄Atropa belladonna L.的全草,別名美女草、別拉多娜草,全草入藥,主要用于胃痙攣,胃、十二指腸潰瘍病,膽絞痛,輸尿管結(jié)石等引起的腹痛,胃炎及胃痙攣引起的嘔吐和腹瀉,迷走神經(jīng)興奮導(dǎo)致的多汗、流涎、心率慢、頭暈等［1-2］, 含有生物堿［3］、 黃酮類［4］、苷類［5］等成分,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、活血等藥理活性［6-8］,原產(chǎn)歐洲中、南部及小亞細亞,我國部分省市有引種栽培,主要集中在山東、湖南、河南、浙江等地［9-10］。目前,其相關(guān)研究主要集中在栽培技術(shù)［11］、 組織快繁［12］、 提取工藝［13］、 植物再生體系［14］、單一成分含有量測定［15］等方面,而對不同產(chǎn)地多樣本活性成分含有量比較的研究較少?？偵飰A與莨菪堿為2015 年版《中國藥典》規(guī)定的顛茄草主要質(zhì)量評價指標(biāo)之一,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、緩解痙攣等功效［16-17］,故課題組收集我國顛茄草主要產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源13 批,紫外可見分光光度法(UV-Vis) 法測定全草總生物堿含有量,反相高效液相色譜(RP-HPLC) 法測定莨菪堿含有量,考察其與生長性狀、生境因子間的相關(guān)性,并進行主成分分析與聚類分析,以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 2017 年6 月至2017 年7 月,收集山東、湖南、河南、浙江、陜西、湖北6 省13 個產(chǎn)地顛茄草種質(zhì)資源,由麗水市人民醫(yī)院湯晟凌副主任藥師鑒定為茄科植物顛茄Atropa belladonna L.的全草,詳見表1。

1.2 儀器與試劑 Waters 600-2998 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；UV2550 紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)；Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore 公司)；SHZ-95B 循環(huán)水式多用真空泵(長沙明杰儀器科技有限公司)；DGG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(上海森信試驗儀器有限公司)；FA2004 電子分析天平(上海恒平精密電子儀器有限公司)；JP-180ST 超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；XL-02A 手提式粉碎機(杭州旭眾機械設(shè)備有限公司)。莨菪堿對照品(SH8960,含有量≥98.0%) 購于北京索萊寶科技有限公司。甲醇(色譜級) 購于德國默克公司；其他試劑均為分析純,購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.3 試驗方法

1.3.1 生境因子與生長性狀考察 記錄每個顛茄草產(chǎn)地經(jīng)度、緯度、海拔,卷尺測量株高,游標(biāo)卡尺與直尺測量主莖粗、葉長、葉寬、葉柄長,電子天平稱量全株鮮重,統(tǒng)計每株萌蘗條數(shù),生物學(xué)重復(fù)15 次。

1.3.2 總生物堿含有量測定［18］將顛茄草全株洗凈,陰干,剪切成段,置于50 ℃烘箱烘至恒定質(zhì)量,粉碎,過60 目篩。取樣品粉末0.5 g,用適量氨水濕潤, 密封放置 30 min, 加三氯甲烷10.0 mL,稱定質(zhì)量,水浴加熱回流提取2 h,冷卻至室溫,補足減失質(zhì)量,抽濾。取2 mL 濾液,三氯甲烷定容至10 mL,依次加入pH 4.5 的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5.0 mL,0.04%溴甲酚綠溶液2.0 mL,劇烈振蕩3 min,靜置30 min,以三氯甲烷為空白對照,620 nm 下測定吸光度。以總生物堿吸光度為縱坐標(biāo)(A),樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行回歸,得方程A ＝13.498 2X-0.056 2(R2＝0.999 6),在0.02～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率101.85%,RSD 1.09%。

1.3.3 莨菪堿含有量測定

1.3.3.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相甲醇-乙酸緩沖液(20 mmol/L 乙酸銨,氨水調(diào)pH 至4.0)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長226 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

1.3.3.2 線性關(guān)系考察 分別配制50、 100、200、300、400、500 μg/mL 溶液,過0.45 μm 微孔濾膜,在“1.3.3.1” 項色譜條件下進樣。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸,得方程Y＝2 325.5X-9 048.9 (R2＝0.999 7), 在50 ～500 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末0.5 g,依次加氨試液5.0 mL、三氯甲烷20 mL,充分混勻,25 ℃下超聲提取(功率250 W、頻率33 kHz)30 min,2 000 r/min 離心5 min,取上清,重復(fù)1 次,合并提取液,旋干,甲醇溶解定容至25 mL 量瓶, 取適量過0.45 μm 微孔濾膜, 在“1.3.3.1” 項色譜條件下進樣。色譜圖見圖1。

1.3.3.4 穩(wěn)定性試驗 取S8 樣品,按“1.3.3.3”項下方法制備供試品溶液,在“1.3.3.1” 項色譜條件下分別于0、2、4、8、16、24 h下進樣,測得莨菪堿峰面積RSD 為1.04%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 莨菪堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hyoscyamine

1.3.3.5 精密度試驗 取莨菪堿對照品溶液,過0.45 μm 微孔濾膜,在“1.3.3.1” 項色譜條件下進樣6 次,測得莨菪堿峰面積RSD 0.54%,表明儀器精密度良好。

1.3.3.6 重復(fù)性試驗 取S8 樣品6 份, 按“1.3.3.3”項下方法制備供試品溶液,在“1.3.3.1”項色譜條件下進樣,測得莨菪堿含有量RSD 為2.35%,表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取莨菪堿含有量已知的S8 樣品,按照低、中、高3 個質(zhì)量濃度依次加入對照品溶液,按“1.3.3.3” 項下方法制備供試品溶液,在“1.3.3.1” 項色譜條件下測定,計算加樣回收率,平行3 次,結(jié)果見表2。

表2 莨菪堿加樣回收率試驗結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests for hyoscyamine（n=3）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 用DPS6.55、SPSS17.0、EXCEL2010 軟件處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析,聚類分析采用類平均法。

2 結(jié)果與分析

2.1 含有量比較 13 個產(chǎn)地顛茄草總生物堿、莨菪堿含有量存在差異, 平均值分別為1.30%、0.70%,其中湖南新田種質(zhì)總生物堿含有量最高,為1.91%；河南羅山種質(zhì)莨菪堿含有量最高,為0.95%；陜西漢陰種質(zhì)總生物堿含有量與莨菪堿含有量均最低,分別為0.79%與0.50%；供試顛茄草總生物堿含有量均滿足2015 年版《中國藥典》規(guī)定的不低于0.30%的標(biāo)準(zhǔn),見表3。

2.2 含有量變異規(guī)律 相關(guān)性分析顯示,13 個產(chǎn)地顛茄草中總生物堿、莨菪堿含有量與植株生長形狀、產(chǎn)地生境因子間關(guān)系密切,見表4?？偵飰A、莨菪堿含有量與株高、主莖粗、分蘗數(shù)、葉長、葉寬、葉柄長、鮮重呈正相關(guān)關(guān)系,與株高相關(guān)性最高,相關(guān)系數(shù)分別為0.785 4、0.717 6；與葉長寬比、緯度、海拔呈負相關(guān)關(guān)系,與海拔相關(guān)性最高,相關(guān)系數(shù)分別為-0.660 7、-0.576 0；與經(jīng)度相關(guān)性較低, 相關(guān)系數(shù)僅為0.079 6、-0.055 9,表明低緯度、低海拔地區(qū)栽培顛茄草有利于其總生物堿、莨菪堿含有量積累。

2.3 主成分分析 10 個生長性狀與成分含有量信息可由4 個主成分概括,累計貢獻率達94.32%,見表5。 由表可知, 第1 主成分特征根值為5.756 2,貢獻率為63.95%,其中除葉長寬比特征根值為負值外,其余生長性狀指標(biāo)特征根值均為較大正值,構(gòu)成變異主要來源,該主成分可定義為生長性狀主因子；第2 主成分特征根值為1.869 9,貢獻率為20.78%,其中葉長寬比特征根值為較大正值0.622 1,構(gòu)成變異主要來源,此成分可定義為葉形指數(shù)因子；第3 主成分特征根值為0.554 7,貢獻率為6.16%,其中總生物堿含有量、莨菪堿

含有量為較大正值,此成分可定義為生物堿含有量因子；第4 主成分特征根值為0.308 7,貢獻率為3.43%,其中鮮重、葉寬為較大正值,構(gòu)成變異主要來源,該成分可定義為生長性狀次因子。主成分分析可有效縮減考察指標(biāo)數(shù)量,避免單一指標(biāo)的片面性和不穩(wěn)定性,為優(yōu)良種質(zhì)篩選提供參考［19］。以第1 主成分Y(i,1)＞1 為入選標(biāo)準(zhǔn),篩選出河南新縣、河南羅山、湖南新田、浙江縉云、浙江磐安5個優(yōu)良種質(zhì),表現(xiàn)出植株高、莖粗、葉片大而寬厚、生長勢好、生物堿含有量高等優(yōu)良性狀。

表3 不同產(chǎn)地樣品生長性狀與2 種成分含有量比較（n=15）Tab.3 Comparison of growth traits and two constituents'contents of samples in different growing areas（n=15）

表4 2 種成分含有量與生長性狀、生境因子相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between two constituents'contents and growth traits，habitat factors

表5 主成分特征值和貢獻率Tab.5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

2.4 聚類分析 以篩選出的4 個主成分為參考指標(biāo),對13 個產(chǎn)地顛茄草進行聚類分析,根據(jù)歐式距離D2＝19.74 的聚類水平,將供試顛茄草劃分為4 個類群,見圖2。類群Ⅰ共6 個種質(zhì),分別為山東棲霞、湖北恩施、山東蘭陵、湖北竹山、陜西漢陰與陜西楊凌,該類群主要為山東、湖北、陜西種質(zhì),植株較矮、莖細、分蘗能力弱、葉片小而寬厚或狹長,生物堿含有量低；類群Ⅱ共2 個種質(zhì),為湖南漣源與湖南株洲,該類群植株中等高度,莖較粗,分蘗能力強,葉片較大而狹長,其中湖南漣源種質(zhì)生物堿含有量較低,而湖南株洲生物堿含有量較高；類群Ⅲ與類群Ⅳ共5 個種質(zhì),分別為湖南新田、湖南新縣、河南羅山、浙江縉云與浙江磐安,此2 類群植株較高,莖粗,分蘗能力強,葉片大而多寬厚,生物堿含有量較高,性狀表現(xiàn)優(yōu)良,見圖2。

圖2 13 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of thirteen batches of samples

3 討論

顛茄草是我國民間傳統(tǒng)用藥,也是提取莨菪堿、東莨菪堿、阿托品的主要植物原料,常制備成流浸膏、浸膏、酊劑、片劑等成藥制劑供臨床使用,具有鎮(zhèn)痛、解痙等作用［20］。目前野生顛茄資源日益匱乏,人工栽培受地域限制,栽培種質(zhì)混亂,不同產(chǎn)地顛茄在生長性狀、活性成分含有量等方面存在差異,故對其進行資源收集與評價,進而篩選優(yōu)良種質(zhì),為相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展與資源利用奠定良好基礎(chǔ)。本研究考察了提取方法(索式、回流、超聲)、提取溫度(20、25、30、35 ℃)、提取時間(30、40、50 min) 對顛茄草中莨菪堿含有量的影響,發(fā)現(xiàn)在25 ℃下超聲提取2 次(30 min/次、功率250 W、 頻率33 kHz) 即可提取完全, 在“1.3.3.1”項條件下莨菪堿出峰時間為19.356 min,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)大于3 500,定量限4.32 μg/mL,檢測限1.56 μg/mL,而且該方法操作簡便,重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,可用于顛茄草藥材質(zhì)量評價。

植物在長期生物進化過程中為了適應(yīng)外界環(huán)境,包括生物性環(huán)境因子(害蟲、微生物) 與非生物性環(huán)境因子(經(jīng)緯度、海拔、溫度、光照)等,形成了一整套生物防御應(yīng)答系統(tǒng),根據(jù)不同環(huán)境刺激來激活細胞表面應(yīng)答信號,進而啟動防御生物鏈,上調(diào)相關(guān)基因表達,釋放抗性因子［21］,植物積累的次生代謝產(chǎn)物是植物防御應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分。本研究結(jié)果表明,13 批顛茄草中總生物堿、莨菪堿平均含有量分別為1.30%、0.70%,前者滿足2015 年版《中國藥典》 規(guī)定的不低于0.30%的標(biāo)準(zhǔn)；我國顛茄草主產(chǎn)區(qū)藥材中兩者含有量存在差異,變幅分別為0.79%～1.91%、0.50%～0.95%,可為良種選育提供豐富的備選種質(zhì)。